固相萃取-超高效液相色谱法测定土壤中氯吡苯脲的残留

2017-10-16,,,,,,

食品工业科技 2017年18期

关键词：乙腈液相净化

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(涪陵出入境检验检疫局,重庆 408000)

固相萃取-超高效液相色谱法测定土壤中氯吡苯脲的残留

郑洋,吴杰,唐璜,王安良,杨文友,徐亚琴,郭禹良

(涪陵出入境检验检疫局,重庆408000)

采用固相萃取-超高效液相色谱法(SPE-UPLC)快速测定土壤中的氯吡苯脲残留量,对比确定了合适的前处理方法,并系统优化了测定方法中的提取和净化条件。实验结果表明:当采用乙腈提取，超声时间为30 min，离心转速为5000 r/min，PSA柱净化，色谱流动相为：V乙睛∶V水=65∶35时土壤中氯吡苯脲的提取效果最佳。氯吡苯脲在0.05～5.0 μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),定量限为0.025 mg/kg,氯吡苯脲的添加回收率为78.34%～102.4%,相对标准偏差为3.24%～6.65%。该方法测定速度快,准确度和精密度符合农药残留分析,能够满足对土壤中氯吡苯脲残留的快速测定要求。

氯吡苯脲,土壤,固相萃取,超高效液相色谱法

Abstract:The forchlorfenuron residues in soil were determined quickly by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography(SPE-UPLC)in this paper. And this paper compared to determine the appropriate pre-treatment methods,optimized the extraction method and purification conditions. The optimal conditions were obtained that the sample was extracted with acetonitrile for 30 min by ultrasonic method, centrifuged in 5000 r/min and cleaned up with the PSA column. Forchlorfenuron was determined by ultra performance liquid chromatography using acetonitrile-water(65∶35) as mobile phase. The developed method showed a good linear relationship in the range of 0.05～5.0 μg/mL for forchlorfenuron,with correlation coefficient of 0.9999. The limit of quantitation for forchlorfenuron was 0.025 mg/kg.The average recovery rates were 78.34%～102.4%,with relative standard deviation(RSD)ranging from 3.24% to 6.65%. The method is fast,highly sensitivity,repeatable and suitable for the determination of forchlorfenuron residues in soil.

Keywords:forchlorfenuron;soil;solid-phase extraction;ultra performance liquid chromatography

氯吡苯脲又称氯吡脲,是一种具有细胞分裂素活性的植物生长调节剂,广泛用于农业中,如果树种植和园艺,具有促进果实肥大、影响细胞分裂、防止花和果实的脱落等作用[1]。中国作为人口大国,科技兴农的需求大,氯吡苯脲的应用规模与范围预计还会不断增加。但是氯吡苯脲摄入过多可能危害人体健康,美国环保署在《农药毒性确认和管理》第5版13章指出,长期接触氯吡苯脲会导致体内蛋白质代谢的紊乱、形体消瘦和轻度的肺气肿[2]。

由于氯吡苯脲具有一定的毒性,国内外学者对常见的蔬菜瓜果中氯吡苯脲残留进行了大量的研究[3-5],但是针对土壤中氯吡苯脲残留的研究较少。目前,由土壤污染引发的农产品质量安全问题逐年增多,成为影响大众身体健康和社会稳定的重要因素。有机农药作为常见的土壤污染物,能够间接被人体吸收,达到危害人体健康的程度[6]。因此开展土壤中氯吡苯脲残留的检测方法研究具有重要意义,不仅可以为土壤安全性评价提供理论依据,也为蔬菜瓜果的食用安全性提出参考意见。

目前,氯吡苯脲残留的测定方法很多,主要有气相色谱法[7-8]、液相色谱法[9-11]以及液相色谱-串联质谱法[12-15]等。近年来兴起的超高效液相色谱法能够提高样品分离度,相对于液相色谱-质谱联用法成本更低、分析速度更快、发展前景广阔。同时,农残分析前处理技术从最初的液液萃取,到固相小柱萃取和分散固相萃取发展,其中固相小柱萃取和QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)提取净化方法[16-17]已成为主流。在土壤中氯吡苯脲残留分析方法的研究上,李佳等[18]研究了氯吡苯脲在土壤和黄瓜中残留的液相色谱分析方法,但其方法有机溶剂消耗量较大,步骤繁琐。本文比较了固相萃取-超高效液相色谱法(SPE-UPLC)和QuEChERS法快速测定土壤中的氯吡苯脲残留量,并以此为基础对样品前处理条件进行了优化,以期建立土壤中氯吡苯脲残留的快速分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯均为色谱纯,TEDLA公司;超纯水由密理博纯水仪制得;氯化钠经120 ℃烘烤6 h后放置于干燥器中备用,分析纯,上海化学试剂公司;无水硫酸钠经650 ℃烘烤6 h后放置于干燥器中备用,分析纯,上海化学试剂公司;无水硫酸镁经140 ℃烘烤6 h后放置于干燥器中备用,分析纯,上海化学试剂公司;固相萃取小柱:丙基乙二胺(PSA)柱、氨基(NH2)柱、C18柱、碱性氧化铝(Al-N)柱、中性氧化铝柱、弗罗里硅土(Florisil)柱 Agela Technologies;分散固相吸附剂:丙基乙二胺(PSA)吸附剂 Agela Technologies;氯吡苯脲标准品 CAS号68157-60-8,纯度99.5%,Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;新鲜土壤样品于2016年11月,采自重庆市涪陵区清溪镇菜地。

安捷伦1290超高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)、色谱柱:AgiLent Zorbax XDB-C18柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm) Agilent Technologies;SCQ-8201A超声波清洗机上海声彦超声波仪器有限公司;JPPM正压固相萃取仪美国J2公司;DEG-200氮气发生器淄博宏润工贸有限公司;N-EVAP TM112氮吹仪 Organomation Associates,Inc.;XW-80A旋涡振荡器上海青浦沪西仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制准确称取1.0 mg氯吡苯脲标准物质,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,所配制的标准储备液置于冰箱保存备用。氯吡苯脲标准储备液用甲醇分别稀释成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL系列标液,超高效液相色谱仪测定,以保留时间定性,峰面积定量,绘制标准工作曲线。

1.2.2 色谱条件色谱柱:AgiLent Zorbax XDB-C18柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm);流动相:V乙睛∶V水=65∶35;柱温:25 ℃;检测器:二极管阵列检测器;波长:260 nm;流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL。

1.2.3 两种前处理方法对土壤中氯吡苯脲提取的影响

1.2.3.1 固相萃取法提取土壤中的氯吡苯脲准确称取新鲜土壤样品5.00 g置于50 mL具塞离心管中,添加0.2 mg/kg氯吡苯脲标准品,加入5.0 mL乙腈,涡旋振荡2 min混匀,超声30 min,取出后加入0.5 g氯化钠,2 g无水硫酸钠,涡旋振荡2 min,在5000 r/min的条件下离心10 min,待净化。将丙基乙二胺PSA分散固相萃取小柱置于正压固相萃取仪上,用4.0 mL淋洗剂乙腈∶甲苯=3∶1 (v/v)预淋洗活化,取离心后上清液2 mL上柱,再用10 mL淋洗剂洗脱,洗脱液用15 mL离心管收集。将收集液置于氮吹仪,于40 ℃水浴,氮吹近干,用甲醇∶水=1∶1 (v/v)溶解残留物定容至1 mL,过0.22 μm有机滤膜,待上机检测。

1.2.3.2 QuEChERS法提取土壤中的氯吡苯脲准确称取新鲜土壤样品5.00 g置于50 mL具塞离心管中,添加0.2 mg/kg氯吡苯脲标准品,加入5.0 mL乙腈,涡旋振荡2 min混匀,超声30 min,取出后加入0.5 g氯化钠,2 g无水硫酸钠,涡旋振荡2 min,在5000 r/min的条件下离心10 min,待净化。准确吸取离心后的提取液2 mL于15 mL离心管中加入100 mg丙基乙二胺(PSA)吸附剂,涡旋2 min,以5000 r/min离心3 min,取上清液过0.22 μm有机滤膜,待上机检测。

1.2.4 固相萃取法前处理方法和流动相优化

1.2.4.1 液相色谱流动相的选择准确称取4份新鲜土壤样品5.00 g置于50 mL具塞离心管中,添加0.2 mg/kg氯吡苯脲标准品,后续处理步骤同实验方法1.2.3.1。处理后待测样分别在流动相为乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸铵水溶液,其他色谱条件同1.2.2进行检测。

1.2.4.2 提取溶剂的选择准确称取5份新鲜土壤样品5.00 g置于50 mL具塞离心管中,添加0.2 mg/kg氯吡苯脲标准品,分别向5支离心管加入5.0 mL提取剂乙腈、乙腈(含1%乙酸)、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯。后续处理步骤同1.2.3.1,每个处理重复2次。

1.2.4.3 超声时间和离心转速的优化准确称取7份新鲜土壤样品5.00 g置于50 mL具塞离心管中,添加0.2 mg/kg氯吡苯脲标准品,加入5.0 mL乙腈,涡旋振荡2 min混匀,其中4份样品分别超声10、20、30、40 min,其余操作同实验方法1.2.3.1,每个处理重复3次。由于受仪器设备条件限制,另外3份样品的离心转速分别设定为4000、5000、6000 r/min,其余操作同实验方法1.2.3.1,每个处理重复2次。

1.2.4.4 固相萃取小柱的选择准确称取6份新鲜土壤样品5.00 g置于50 mL具塞离心管中,添加0.2 mg/kg氯吡苯脲标准品按实验方法1.2.3.1进行提取处理。提取后6份样品分别采用PSA柱、Florisil柱、氨基柱、C18柱、碱性氧化铝和中性氧化铝进行净化,净化步骤同实验方法1.2.3.1,每个处理重复2次。

1.2.5 方法的定量限、准确度和精密度实验通过对固相萃取前处理方法的优化,得到最佳测定条件。在此基础上向空白土壤样品中分别添加一系列不同水平的氯吡苯脲,得到氯吡苯脲定量限。然后选取4个不同水平(0.025、0.05、0.25、2 mg/kg)的氯吡苯脲,测定氯吡苯脲含量,并计算回收率。在相同条件下,每个添加水平重复6次,计算相对标准偏差(RSD)。

2 结果与讨论

2.1 两种前处理方法对土壤中氯吡苯脲提取效果比较

两种前处理方法对土壤加标样品的提取净化效果如图1和图2所示。

图1 固相萃取法处理土壤加标样品的液相色谱图Fig.1 Chromatography of spiked soil sample extracted by SPE method

图2 QuEChERS法处理土壤加标样品的液相色谱图Fig.2 Chromatography of spiked soil sample extracted by QuEChERS method

从图1和图2可以发现,两种前处理方法均能从土壤中提取出氯吡苯脲,目标峰峰形尖锐呈高斯分布,周围杂峰较少,有利于氯吡苯脲的定性定量检测,都适合土壤中氯吡苯脲的提取。进一步对比两种方法处理土壤样品得到的色谱图,在保留时间为1.4～3.0 min的区域内,QuEChERS法所得的色谱图基线更高,说明其极性干扰物质的含量较多。同时,采用固相萃取法得到的上机溶液为无色透明溶液,QuEChERS法得到的上机溶液为浅绿色样品溶液。说明固相萃取法处理后净化液中色素含量较少。两种前处理方法下氯吡苯脲的回收率如表1所示。结果表明,QuEChERS法平均回收率为54.68%,提取效果不佳,超出残留检测要求范围。而固相萃取法平均回收率为91.64%,能够有效提取土壤中的氯吡苯脲,相对标准偏差为2.43%,重现性较好,能够满足残留检测的要求。因为固相萃取法在净化过程中,提取液靠重力以较低流速通过固相萃取柱,这使提取液与吸附剂接触充分,从而有效去除掉色素、有机酸等杂质[19]。因此,本文选取固相萃取法作为土壤中氯吡苯脲的提取分析方法,并进一步优化。

表1 两种前处理方法下氯吡苯脲的回收率Table 1 Forchlorfenuron recoveries in two pretreatment methods

2.2 固相萃取法前处理方法和流动相优化

2.2.1 液相色谱条件中流动相的选择本文首先在实验室前期工作[20]的基础上选择了V乙睛∶V水=65∶35,流速:0.3 mL/min作为流动相条件。实验发现,在此流动相条件下,待测物峰形及灵敏度都较好,目标峰附近无杂峰。查阅文献发现徐永等[12]在流动相中加入少量酸可改变不同组分的保留时间,使目标物和杂质有更好的分离。因此,在乙腈-水流动相中分别加入了0.1%的甲酸、乙酸和乙酸铵进行实验。实验结果表明,流动相加甲酸、乙酸或者乙酸铵对峰形无明显改善,且会增加流动相配制的步骤和成本,综合考虑选择乙睛-水作为流动相。

2.2.2 不同提取剂的提取效果比较由于氯吡苯脲易溶于有机溶剂,且乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯都是常用的农残提取溶剂。同时,有学者采用酸性乙腈(1%乙酸)提取氯吡苯脲,获得了较为理想的结果[21]。因此选取了乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、乙腈(1%乙酸)等作为氯吡苯脲的提取溶剂。实验结果如表2所示。

表2 不同提取溶剂的提取效果比较Table 2 Extraction effects by several extraction solvents

结果发现,采用乙酸乙酯作为提取溶剂得到的氯吡苯脲峰形不好,无法准确定量,故未选择。其他提取溶剂中,二氯甲烷的提取效果不佳,且对人体的毒性较大。采用甲醇作为提取溶剂时,会溶解出更多的色素和杂质,导致氯吡苯脲回收率下降[3]。而乙腈的提取效果优于其他溶剂。因为乙腈为极性溶剂,其对脂肪、糖、蛋白质的溶解度较小,且降低了基体杂质的溶出。同时,乙腈的低挥发性也能够减少对人体健康和生态环境的危害[22]。因此,本实验选择乙腈作为土壤中氯吡苯脲的提取溶剂。

2.2.3 超声时间和离心转速对氯吡苯脲提取效果的影响本文进一步研究不同超声时间对土壤中氯吡苯脲提取效果的影响。从图3可以看出,超声时间从10 min变化至30 min时,氯吡苯脲回收率从84.53%增加到91.63%,说明氯吡苯脲提取效果随超声时间增加而明显提高。超声时间超过30 min,氯吡苯脲回收率趋向平稳,说明超声30 min即可将土壤中氯吡苯脲提取完全。故本实验选择超声时间为30 min。由于受仪器设备条件限制,分别考察了离心转速为4000、5000、6000 r/min时土壤中氯吡苯脲的提取效果。从图4可以看出,三个离心转速条件下氯吡苯脲回收率均能达到84%以上,离心转速从4000 r/min变化至6000 r/min时,氯吡苯脲回收率在84.95%和91.98%之间变化,差异不明显。其中离心转速为5000 r/min时氯吡苯脲回收率最高,相对标准偏差为1.10%,土壤中氯吡苯脲的提取效果最佳。因此本实验选择离心转速为5000 r/min。

图3 不同超声时间的提取效果比较Fig.3 Extraction effects by different ultrasound time

图4 不同离心转速的提取效果比较Fig.4 Extraction effects by different centrifugal speed

2.2.4 固相萃取小柱的净化效果比较由于土壤成分复杂,为了增强净化效果,本实验通过查阅文献[23-24]后筛选了6种固相萃取小柱,分别为PSA柱、Florisil柱、氨基柱、C18柱、碱性氧化铝柱和中性氧化铝柱。研究了不同固相萃取小柱对土壤加标样品的净化处理效果,得到氯吡苯脲回收率如表3所示。

表3 采用不同固相萃取柱获得的回收率比较Table 3 Forchlorfenuron recoveries of the different kinds of solid phase extraction column

结果表明,不同固相萃取小柱都具有一定的净化除杂效果。在氯吡苯脲添加水平为0.20 mg/kg时,PSA柱对土壤样品的净化效果最佳,回收率达到93.55%,且样品测定时无干扰。Florisil柱、氨基柱和C18柱对土壤样品的净化效果较好,回收率均能达到85%以上。但碱性氧化铝和中性氧化铝对土壤样品的净化效果不佳,回收率较低。林涛等[22]比较了氨基柱、Florisil柱、碱性氧化铝柱的净化富集效果,发现氨基柱、Florisil柱、碱性氧化铝柱的净化效果,与本实验结果一致。可能是由于PSA柱和氨基柱所含有的氨基基团更有利于氯吡苯脲的净化。因此综合文献结果和实验数据本实验选择PSA柱。

2.3 方法的线性关系

在选定的色谱条件下,分别对一系列浓度的氯吡苯脲标液进行测定,以氯吡苯脲标样的峰面积为纵坐标(Y),进样浓度(μg/mL)为横坐标(X)做标准曲线,得到线性回归方程为Y=272.3732X-1.9836。结果表明,在0.05～5.0 μg/mL范围内,线性关系良好,r=0.9999。

2.4 方法的定量限、准确度和精密度

通过不同水平的土壤样品加标实验,结合取样量和稀释倍数,得到氯吡苯脲的定量限为0.025 mg/kg。方法的准确度和精密度可通过添加回收率实验来考察。按上述优化后的实验方法,对氯吡苯脲加标样品进行了含量测定并计算回收率和相对标准偏差(RSD),结果见表4。由表4可知,本实验方法在从低至高四个水平下,平均回收率在78.34%～102.4%之间,相对标准偏差在3.24%～6.65%之间。实验结果表明,本方法的准确度和精密度较好。采用此方法检测土壤中氯吡苯脲的残留量,准确可靠,符合农药残留的检测要求。

表4 氯吡苯脲的土壤加标回收率及相对标准偏差Table 4 The recovery and relative standard deviation of forchlorfenuron in soil

2.5 实际样品的测定

采用建立的方法对涪陵区清溪镇菜地采集的10个土壤样品进行氯吡苯脲残留测定,测定结果为10个土壤样品均未检测出氯吡苯脲。

3 结论

本文研究了土壤中的氯吡苯脲残留量的检测方法。实验结果表明固相萃取法可有效提取土壤中的氯吡苯脲,较好地去除土壤中的杂质对检测的影响。进一步优化了固相萃取法,当采用乙腈提取,超声时间为30 min,离心转速为5000 r/min,PSA柱净化,色谱流动相为:V乙睛∶V水=65∶35,流速0.3 mL/min时土壤中氯吡苯脲的提取效果最佳。氯吡苯脲在0.05～5.0 μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),定量限为0.025 mg/kg,氯吡苯脲的添加回收率为78.34%～102.4%,相对标准偏差为3.24%～6.65%。同时,该方法每次进样分析时间仅为8 min,测定速度快。说明所建方法具有灵敏度高、快捷简便等特点,准确度和精密度符合农药残留分析,能够满足对土壤中氯吡苯脲残留的快速测定要求。

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Residuedeterminationofforchlorfenuroninsoilbysolid-phase
extractionandultraperformanceliquidchromatography

ZHENGYang,WUJie,TANGHuang,WANGAn-liang,YANGWen-you,XUYa-qin,GUOYu-liang

(Fuling Entry-exit Inspection Quarantine Bureau,Chongqing 408000,China)

TS207.5

1002-0306(2017)18-0264-05