海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

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(大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034)

海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

郭晓坤,李傲婷,韩佳润,杜椅楠,郭天民,于翠平,唐越,吴海涛*

(大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连116034)

本研究以海参肠为原料,采用pH3.0 50 mmol/L 甘氨酸-盐酸缓冲体系,按1∶6 (w/v)的料液比,在4 ℃浸提1 h,获得海参肠组织蛋白酶D的粗酶液。以酸变性牛血红蛋白为底物,进行酶活测定,并研究了该酶的酶学性质。结果表明,海参肠组织蛋白酶D粗酶的最适pH为3.0,在pH3.0～7.0之间稳定性较好;最适反应温度为50 ℃,在4～40 ℃具有较高稳定性。5 mmol/L的金属离子Mg2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+和K+对该酶有激活作用,而Fe3+和Fe2+则对其有抑制作用。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对该酶活性有较强的抑制作用。上述结果说明,在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。

海参肠,组织蛋白酶D,提取,酶学特性

Abstract:The crude cathepsin D was obtained from sea cucumber(Stichopusjaponicus)guts in this paper. The crude cathepsin D was extracted by using 50 mmol/L Glycine-HCl buffer(pH3.0)with material to solvent ratio of 1∶6 (w/v)at 4 ℃ for 1 h. The activity and characterization of the enzyme were investigated by using acid denatured hemoglobin as a substrate. The results showed that the optimum pH of the crude cathepsin D was pH3.0 and was stable between pH3.0～7.0. The crude cathepsin D exhibited its optimal temperature at 50 ℃ and was stable at 4～40 ℃. The crude cathepsin D was activated by metal ions of Mg2+,Ca2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+and K+,while inhibited by Fe3+and Fe2+at concentration of 5 mmol/L. The crude cathepsin D was strongly inhibited by aspartic protease inhibitor pepstatin A. These results suggested that the crude cathepsin D obtained fromS.japonicusguts was acid protease maily composed of aspartic protease under the condition of present study.

Keywords:sea cucumber gut;cathepsin D;extraction;enzyme characterization

海参(Stichopusjaponicus)是不含胆固醇的食用资源,富含多种活性成分,营养价值高,被视为佐膳佳品和理想滋补品[1]。但海参易发生自溶,给其运输和加工造成了诸多不便,并引起了经济损失[2]。自溶主要由内源酶作用引起的,目前已从海参组织中分离获得多种内源酶,例如半胱氨酸蛋白酶[3]、类组织蛋白酶L[4]、酸性磷酸酶[5]、组织蛋白酶B[6]、乙酰胆碱酯酶[7]、碱性磷酸酶[8]等,对这些酶的研究为揭示海参的自溶机理奠定了基础。

组织蛋白酶D是一种重要的胞内天冬氨酸蛋白酶,在生物界中广泛存在。组织蛋白酶D具有多种生物功能,参与胞内蛋白质的降解,酶原、激素和生长因子的激活[9]。目前,关于哺乳动物来源的组织蛋白酶D的相关研究已较为广泛,已从人、牛及猪的组织中分离纯化出了组织蛋白酶D[10-12]。关于水产品组织蛋白酶D的研究也有相关报道,主要集中在大宗水产品。例如,Jiang等[13]利用pH7.0 20 mmol/L磷酸盐缓冲液,按1∶5 (w/v)的料液比,对罗非鱼肌肉脱脂粉中的组织蛋白酶D进行了提取,获得粗酶液后,经进一步纯化,获得罗非鱼组织蛋白酶D,该酶的最适pH为3.5,最适温度为37 ℃;Wang等[14]利用pH2.5 100 mmol/L McIlvaine缓冲液,按1∶4 (w/v)的料液比,对大西洋鳕鱼肝脏组织蛋白酶D进行了提取及纯化,该酶水解酸变性牛血红蛋白的最适pH为3.0;Balti等[15]利用pH3.0 10 mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲液,按1∶10 (w/v)的料液比,从乌贼肝胰脏中获得了组织蛋白酶D的粗酶液;Merino等[16]采用pH7.4 25 mmol/L Tris-HCl缓冲液,按1∶4 (w/v)的料液比,对海星组织蛋白酶D进行了提取,并纯化得到海星组织蛋白酶D。然而,关于海参来源的组织蛋白酶D的研究,国内外尚未见报道。

因此,本研究以海参加工中的副产物为研究对象,从海参肠中提取了组织蛋白酶D,并对其提取条件和酶学性质进行了研究,以期为进一步开发利用海参肠奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜海参 大连长兴水产市场;L-酪氨酸、Folin酚、牛血红蛋白、考马斯亮蓝R-250 上海生工生物工程技术服务有限公司;胃酶抑素A(Pepstatin A)、苯甲磺酰氟(PMSF)、反-环氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷(E-64)、碘乙酸(IAA) 美国Sigma-Aldrich公司;其他试剂 均为国产分析纯。

BS224S电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;Scientz-Ⅲ型数控层析冷柜 宁波新芝生物科技股份有限公司;DF-101S恒温加热磁力搅拌器、98-2强磁力搅拌器 巩义予华仪器有限公司;HITACHI CF16RXII离心机 日本株式会社日立制作所;XW-80A漩涡振荡器 上海精科实业有限公司;Infinite200 NANO酶标定量测定仪 TECAN(上海)贸易有限公司;明澈TM-D24UV纯水系统 美国Millipore公司;IKA T25匀浆机 德国IKA公司;UV-5200型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海参肠组织蛋白酶D提取条件的确定

1.2.1.1 提取缓冲液pH的确定 配制不同pH的缓冲液:50 mmol/L Glycine-HCl缓冲液(pH2.0～3.0);50 mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.0～5.0);50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH6.0～8.0)。称取15 g海参肠,分别加入75 mL上述缓冲液,冰浴中匀浆,浸提12 h,4 ℃、8500×g下冷冻离心30 min,收集上清,测定蛋白含量和总酶活力,以总酶活力最高者为100%,用相对总酶活力来表示。

1.2.1.2 料液比的确定 称取15 g海参肠,分别加入30、45、60、75、90和105 mL(料液比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)pH3.0 50 mmol/L Glycine-HCl缓冲液,冰浴中匀浆,浸提12 h,4 ℃、8500×g下冷冻离心30 min,收集上清,测定蛋白含量和总酶活力,以总酶活力最高者为100%,用相对总酶活力来表示。

1.2.1.3 提取时间的确定 称取15 g海参肠,加入90 mL pH3.0 50 mmol/L Glycine-HCl缓冲液,冰浴中匀浆,分别浸提0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14和16 h,4 ℃、8500×g下冷冻离心30 min,收集上清液,测定蛋白含量和总酶活力,以总酶活力最高者为100%,用相对总酶活力来表示。

1.2.2 海参肠组织蛋白酶D酶活力的测定 组织蛋白酶D活力的测定以酸变性牛血红蛋白为底物,参考Anson等[17]的方法,并略有修改。具体方法如下:75 μL酶液和525 μL pH3.0 100 mmol/L Glycine-HCl缓冲液混合,加入150 μL 2% 酸变性牛血红蛋白开始反应,在37 ℃孵育2 h,加入750 μL 8% TCA终止反应,10000×g离心30 min,收集上清,用Lowry法[18]测定TCA中酶水解底物释放的肽的含量。以L-酪氨酸为标准品,所得标准曲线为y=0.0034x+0.0026(R2=0.9997)。在空白对照组中,按照上述条件,将酶液与底物溶液分别进行孵育2 h,在酶液中加入750 μL 8% TCA使酶失活,再与底物混合。

酶活力单位的定义:在pH3.0,37 ℃条件下,每2 h水解酸变性牛血红蛋白产生1 μg酪氨酸类似物所需要的酶的量为一个酶活力单位(U)。

酶比活力的计算:酶比活力(U/mg)=总酶活力(U)/蛋白质质量(mg)

1.2.3 蛋白含量的测定 蛋白含量的测定参考杜英[19]的方法,具体方法如下：取1 mL酶液,加入4 mL考马斯亮蓝溶液,混匀,静置2 min,于595 nm下测吸光值。以牛血清蛋白为标准品,所得标曲为y=0.0191x+0.0081(R2=0.9986)。

1.2.4 海参肠组织蛋白酶D的酶学性质

1.2.4.1 pH对酶活性和稳定性的影响 考察pH对酶活性的影响时,按1.2.2中酶活力的测定方法,反应体系采用pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的缓冲液,所用缓冲液如下:100 mmol/L Glycine-HCl缓冲液(pH1.0～3.0);100 mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.0～6.0);100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0～8.0),以酶活力最高者为100%。考察pH对酶稳定性的影响时,按1.2.2中酶活力的测定方法,先将酶液与不同pH的缓冲液混合,在25 ℃孵育60 min,再加入底物开始反应,测定酶活力,以酶活力最高者为100%,用相对酶活力来表示。

1.2.4.2 温度对酶活性和稳定性的影响 考察温度对酶活性的影响时,按1.2.2中酶活力的测定方法,将反应温度设置为20、30、40、50、60、70和80 ℃,以酶活力最高者为100%。考察温度对酶稳定性的影响时,按1.2.2中酶活力的测定方法,先将酶液和pH3.0缓冲液混合,在4、10、15、20、30、40、50、60、70和80 ℃条件下预先孵育30 min,立即在冰上冷却,测定酶活力,以酶活力最高者为100%,用相对酶活力来表示。

1.2.4.3 金属离子对酶活性的影响 按1.2.2中酶活力的测定方法,先将酶液与pH3.0 100 mmol/L Glycine-HCl缓冲液混合,加入不同金属离子的氯盐溶液,在37 ℃孵育30 min,然后加入底物开始反应。所用金属离子如下:Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+、Fe2+和Fe3+,终浓度为5 mmol/L。以未加金属离子的情况所测酶活力为100%。

1.2.4.4 抑制剂对酶活性的影响 按1.2.2中酶活力的测定方法,先将酶液与pH3.0 100 mmol/L Glycine-HCl缓冲液混合,加入抑制剂,在25 ℃孵育30 min,然后加入底物开始反应。本文所用抑制剂浓度接近文献报道中所采用的浓度[15,20],其在反应体系中的终浓度如下:PMSF(5 mmol/L)、IAA(1 mmol/L)、E-64(0.1 mmol/L)和Pepstatin A(1 mmol/L)。以未加抑制剂的情况所测酶活力为100%。

1.3 数据处理

每个样品设三组平行,实验数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 13.0软件进行显著性分析,p<0.05时具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 海参肠组织蛋白酶D提取条件的确定

2.1.1 缓冲液pH对海参肠组织蛋白酶D提取效果的影响 缓冲液pH对相对总酶活力、蛋白质含量及相对比活力的影响如图1所示。以相对比活力为主要考察指标,探究浸提缓冲液pH对海参肠组织蛋白酶D提取效果的影响。由图1可知,随着提取缓冲液pH的增加,相对比活力呈现出递减的趋势,其中pH2.0时,相对比活力最高。但pH2.0时,海参肠组织蛋白酶D的相对总酶活力较低,仅为pH3.0时的1/3左右。此外,pH2.0时,蛋白质的溶出量极低,这也正是导致pH2.0条件下相对比活力偏高的原因。因此,综合考虑提取缓冲液pH对相对总酶活力、蛋白质含量及相对比活力的影响,将提取缓冲液的pH定为pH3.0,该提取条件与从乌贼肝胰脏提取组织蛋白酶D[15]时所用的pH(pH3.0)相一致,与从大西洋鳕鱼[14]中提取组织蛋白酶D时所用的pH(pH2.5)相接近。

图1 缓冲液pH对海参肠组织蛋白酶D相对总酶活力、蛋白浓度和相对比活力的影响Fig.1 Effect of different buffer pH on relative total activity,protein concentration and relative specific activity of cathepsin D from sea cucumber guts

2.1.2 料液比对海参肠组织蛋白酶D提取效果的影响 以相对比活力为主要考察指标,探究料液比对海参肠组织蛋白酶D提取效果的影响。由图2可知,随提取缓冲液体积的增加,相对比活力呈现出增加的趋势,但增加趋势逐渐减缓,当料液比(w/v)为1∶6以后,相对比活力开始无明显增加,因此,将提取条件的料液比(w/v)设为1∶6。

图2 料液比对海参肠组织蛋白酶D相对比活力的影响Fig.2 Effect of material liquid ratio on relative specific activity of cathepsin D from sea cucumber guts

2.1.3 浸提时间对海参肠组织蛋白酶D提取效果的影响 以相对比活力为判断依据,探究浸提时间对组织蛋白酶D提取效果的影响。由图3可知,提取时间小于1 h时,酶的溶出量逐渐增加,比活力呈增加趋势,提取时间大于1 h时,相对比活力随着提取时间的增加而减小,这可能由于在长时间的浸提过程中,杂蛋白的含量提高或者在浸提过程中部分组织蛋白酶D发生了降解,致使相对比活力下降,因此将提取时间设为1 h。

图3 浸提时间对海参肠组织蛋白酶D相对比活力的影响Fig.3 Effect of different time on relative specific activity of cathepsin D from sea cucumber guts

2.2 海参肠组织蛋白酶D的酶学性质

2.2.1 pH对海参肠组织蛋白酶D活性和稳定性的影响 在不同pH条件下,酶和底物分子中基团的解离程度不同,从而影响分子的构像以及底物与酶的结合能力和催化能力。pH对酶活性的影响如图4所示,以牛血红蛋白为底物时,海参肠组织蛋白酶D在pH1.0～7.0范围内均呈现出活性,其最适pH在pH3.0附近。这与乌贼肝胰脏[15]以及大西洋鳕鱼肝脏[14]组织蛋白酶D的最适pH相接近。通常认为,不同来源的组织蛋白酶D的最适pH介于pH3.0～5.0之间[15]。此外,也有报道认为,在酸性条件下,组织蛋白酶D的最适pH可能会因选用的蛋白底物的变化而发生改变[21-22]。pH对酶稳定性的影响如图4所示,海参肠组织蛋白酶D在pH3.0～7.0,25 ℃条件下孵育60 min均可保持80%以上的相对比活力,当pH高于7.0时,活性快速下降,pH8.0时,相对比活力仅为47.1%。而Jiang等[23]对斑节虾和草虾组织蛋白酶D进行研究时则发现,两种组织蛋白酶D的pH稳定区间分别为pH5.0～7.0和pH4.0～8.0。这种现象表明组织蛋白酶D的酶学性质可能因其来源的不同而存在差异。

图4 pH对海参肠组织蛋白酶D活性和稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on the activity and the stability of cathepsin D from guts of sea cucumber

表1 金属离子对海参肠组织蛋白酶D活性的影响Table 1 Effects of matel ions on cathepsin D of sea cucumber guts

注:*与空白对照组比较,具有显著差异(p<0.05)。

2.2.2 温度对海参肠组织蛋白酶D活性和稳定性的影响 由图5可知,在20～50 ℃的范围内,海参肠组织蛋白酶D的活性随温度的上升而上升,在50 ℃达到最大值,随着温度进一步升高,酶活力快速下降,70 ℃时相对比活力仅为4.9%。海参肠组织蛋白酶D的最适反应温度与乌贼肝胰脏[15]、鲤鱼肌肉[24]以及斑节虾组织蛋白酶D[23]的最适温度一致,但比鸵鸟肌肉组织蛋白酶D[25]的最适温度要高(45 ℃),比贻贝组织蛋白酶D[26]的最适温度要低(60 ℃),这也再次表明组织蛋白酶D的酶学性质可能因来源的不同而存在差异。温度对酶稳定性的影响如图5所示,当温度低于40 ℃时,海参肠组织蛋白酶D的活性可以稳定在74%以上,当温度高于40 ℃时活性快速下降,当在50 ℃孵育30 min时,酶活损失率约为74.5%,当温度高于60 ℃时,几乎完全失活。研究发现,鸡肠道组织蛋白酶D[27]在pH3.6,50 ℃的条件下孵育30 min,酶活性几乎没有损失,牛组织蛋白酶D[28]在pH3.5,50 ℃的条件下孵育30 min,残存酶活性仍高于70%。海参肠组织蛋白酶D的热稳定性相对较差,这可能与海参栖息环境及生活习性相关,海参通常在温度较低的秋冬季节生长,夏季进入休眠期,海参体内蛋白酶的酶学特性可能与该生理现象相适应。

图5 温度对海参肠组织蛋白酶D活性和稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity and the stability of cathepsin D from guts of sea cucumber

2.2.3 金属离子对海参肠组织蛋白酶D活性的影响 由表1可知,以酸变性牛血红蛋白为底物时,Mg2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+和K+对海参肠组织蛋白酶D有激活作用,Fe3+和Fe2+对海参肠组织蛋白酶D有抑制作用。研究表明,乌贼肝胰脏[15]和罗非鱼肌肉组织蛋白酶D[13]的活性受多种金属离子的影响,Mg2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+和Cd2+对两种来源的组织蛋白酶D均具有激活能力,Fe3+则对两种来源的组织蛋白酶D的活性具有抑制能力,与本研究结果相一致。

2.2.4 抑制剂对酶活性的影响 抑制剂对海参肠组织蛋白酶D活性的影响如表2所示,天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A,半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和IAA在相应的浓度下,均可显著抑制海参肠组织蛋白酶D的活性(p<0.05)。

表2 抑制剂对海参肠组织蛋白酶D活性的影响Table 2 Effects of inhibitor on cathepsin D from guts of sea cucumber

注:*与空白对照组比较,具有显著差异(p<0.05)。

但是,5 mmol/L丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对海参肠组织蛋白酶D无显著抑制作用。Jamdar等[27]在研究鸡肠道中纯化的天冬氨酸蛋白酶时发现,10 μmol/L Pepstatin A可完全抑制鸡肠道组织蛋白酶D的活性,1 mmol/L PMSF可抑制该组织蛋白酶D的部分活性,10 μmol/L E-64则对该组织蛋白酶D无任何影响;Rafik等[15]研究乌贼肝胰腺组织蛋白酶D时发现,1.5 μmol/L Pepstatin A可完全抑制该酶活性,1 mmol/L E-64和1 mmol/L IAA可分别抑制该酶部分活性,而5 mmol/L PMSF则无任何影响;Jiang等[29]在比较鲭鱼和遮目鱼肌肉组织蛋白酶D的性质时发现,1.46 μmol/L Pepstatin A可完全抑制两种鱼肌肉组织蛋白酶D的活性,1 mmol/L IAA和1 mmol/L PMSF均可抑制鲭鱼和遮目鱼肌肉组织蛋白酶D 的部分活性。Jiang等[13]认为来自不同动物组织的组织蛋白酶D水解牛血红蛋白的活性均可受到Pepstatin A的抑制,本研究有类似的结果。但在本研究中Pepstatin A并没有完全抑制海参肠组织蛋白酶D的活性,可能是由于本研究中使用的是海参肠组织蛋白酶D的粗酶。粗酶中可能含有一些其他的酶类,Pepstatin A对这些酶类没有抑制作用或者抑制作用较弱,因此出现了未完全抑制的现象。

3 结论

本研究所确定的海参肠组织蛋白酶D的提取条件为,在4 ℃,利用50 mmol/L pH3.0 Glycine-HCl缓冲液,按1∶6的料液比(w/v)浸提1 h;海参肠组织蛋白酶D的酶学性质研究表明,该酶水解酸变性牛血红蛋白的最适pH为3.0,最适温度为50 ℃,在pH3.0～7.0,4～40 ℃的范围内活性较为稳定;金属离子Fe3+和Fe2+可抑制该酶活性,Mg2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+和K+对该酶有激活作用;蛋白酶抑制剂E-64、碘乙酸和Pepstatin A均可显著抑制海参肠组织蛋白酶D粗酶的活性。在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。

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ExtractionandcharacterizationofcathepsinD
fromseacucumber(Stichopusjaponicus)guts

GUOXiao-kun,LIAo-ting,HANJia-run,DUYi-nan,GUOTian-min,YUCui-ping,TANGYue,WUHai-tao*

(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,National Engineering Research Center of Seafood,Dalian 116034,China)

TS254

A

1002-0306(2017)18-0135-06

2017-02-13

郭晓坤(1990-)，男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail:gxkzy2016@126.com。

*通讯作者:吴海涛(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：wht205@163.com。

国家自然科学基金资助项目(31370037)；辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2015050)；大连市高层次人才创新支持计划项目(2015R083)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.026