响应曲面法优化云南武定鸡胸肉酶解工艺

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(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201;2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心,云南昆明 650201)

响应曲面法优化云南武定鸡胸肉酶解工艺

宋武刚1,2,王桂瑛1,2,程志斌2,谷大海1,2,徐志强1,2,朱仁俊1,*,廖国周1,2,*

(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明650201;2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心,云南昆明650201)

武定鸡,鸡胸肉,水解度

Keywords:Wuding chicken;chicken breast;degree of hydrolysis

我国拥有极为丰富的地方优质肉鸡品种资源,目前已经成为第二大鸡肉生产和消费国。肉鸡在国内市场上除整只活鸡销售外,主要是以各部位分割后制成熟食销售,一些带骨产品受到我国消费者的普遍欢迎,而具有高蛋白、低脂肪等特点的鸡胸肉,因其口感不佳,市场开拓不够广,价格也偏低[1-3]。由于生产技术和加工设备的落后,我国肉鸡的精深加工程度仅为5.8%,与世界的20%存在较大差距,而云南可能更低,而且受制于传统消费观念和饮食习惯及资金技术支持,云南地方优质肉鸡产业发展缓慢[4-6]。云南武定鸡具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩鲜美的特点,为云南“六大名鸡”之首,武定阉鸡则是武定鸡中的精品,被称为“武定壮鸡”,其肉质更细嫩,氨基酸、必需氨基酸和风味氨基酸含量更高[7-9]。目前,武定鸡的研究主要集中在营养成分测定及营养代谢相关基因的分析,对武定鸡进行精深加工和产品开发鲜有报道[10-13]。

蛋白酶解技术在畜产品和水产品的开发利用方面已经被广泛应用,通过蛋白酶水解蛋白质可以提供高附加值产品,产品包括药物、人类和动物营养品、化妆品、微生物氮源和天然抗氧化生物活性肽等,这些酶解产物经过精深加工后,不仅具有优于其他生物活性化合物的特点,而且能赋予产品营养与功能等性质[14-17]。Schmidt[18]、白腾辉[19]、闫利萍[20]等人对鸡胸肉酶解工艺条件进行了研究,孙杨赢[21]、唐道邦[22]等对鸡胸肉酶解液的抗氧化活性做了研究,而利用这些酶解产物与氨基酸、还原糖和(或)香辛料发生美拉德反应制备热反应香精和天然调味料的技术可以避免风味的损失以及营养的流失,一直是研究的热点[23]。因此,利用蛋白酶解技术可以对鸡胸肉进行精深加工,不仅可以扩大鸡胸肉产品的市场,还可以提高鸡胸肉的附加值,创造更大的经济效益,具有广泛的开发前景。本研究以150日龄武定阉母鸡胸肉为原料,通过筛选高效的水解酶,研究了两种酶复配的最佳酶解工艺条件,为后期开发特色风味调味料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

150日龄武定阉母鸡鸡胸肉 云南农业大学实验种鸡场;木瓜蛋白酶(80 U/g)、中性蛋白酶(10 U/g)、风味蛋白酶(10 U/g)、动物蛋白酶(15 U/g) 江苏锐阳生物科技有限公司;甲醛和氢氧化钠(分析纯) 天津市凤船化学试剂科技有限公司;磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(食品级) 连云港友进食品添加剂技术开发有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

BCD-254冰箱 SIEMENS;101型干燥箱 北京中兴;MJ-BL25c4搅拌机 广东美的;JJ-1增力搅拌器 常州澳华;DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅 天津泰斯特;DT5-2型低速台式离心机 北京时代北利;KDN-04B半自动凯氏定氮仪 浙江托普。

1.2 实验方法

1.2.1 水分测定 采用GB/5009.3-2010中直接干燥法测定[24]。

1.2.2 总氮测定 参照GB/T 9695.11-2008测定[25]。

1.2.3 酶解工艺 鸡胸肉→捣碎→一定pH缓冲液溶解→加酶→恒温水解→灭酶(100 ℃,10 min)→离心(5000 r/min,10 min)→上清液为酶解产物。

1.2.4 单一酶筛选实验 根据风味蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶性质及预实验结果确定酶解基本条件,以水解度为指标,考察不同酶的酶解效果。

1.2.4.1 酶添加量实验 固定温度50 ℃,初始pH6.5,酶解时间4 h,四种酶添加量分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%(以鸡胸肉干重计,下同),考察酶添加量对水解度的影响。

1.2.4.2 酶解时间实验 固定温度50 ℃,初始pH6.5,四种酶添加量为0.25%,酶解时间分别为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h,考察反应时间对水解度的影响。

1.2.4.3 酶解温度实验 固定四种酶添加量为0.25%,初始pH6.5,酶解时间4 h,酶解温度分别为45、50、55、60 ℃,考察酶解温度对水解的影响。

1.2.4.4 酶解pH实验 固定四种酶添加量为0.25%,酶解温度50 ℃,酶解时间4 h,酶解pH分别为5.5、6、6.5、7、7.5,考察酶解初始pH对水解度的影响。

1.2.5 复配酶单因素实验 根据1.2.4所得到的实验结果,以水解度为指标,研究酶复配比例、酶添加量、反应时间、反应温度和pH对复配酶酶解效果的影响。

1.2.5.1 酶复配比例 固定温度50 ℃,初始pH6.5,酶解时间5 h,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶总添加量为0.3%,研究两种酶不同比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)对酶解效果的影响。

1.2.5.2 复配酶添加量 固定温度50 ℃,初始pH6.5,酶解时间5 h,木瓜蛋白酶与中性蛋白酶添加比例为2∶1,研究不同添加量(0.15%、0.225%、0.3%、0.375%、0.45%)对酶解效果的影响。

1.2.5.3 酶解时间 固定复配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),温度50 ℃,初始pH6.5,研究不同酶解时间(3、3.4、4、4.5、5、5.5、6 h)对酶解效果的影响。

1.2.5.4 酶解温度 固定复配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),时间5 h,初始pH6.5,研究不同酶解温度(45、50、55、60 ℃)对酶解效果的影响。

1.2.5.5 酶解pH 固定复配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),时间5 h,温度50 ℃,研究不同酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5)对酶解效果的影响。

1.2.6 响应面试验 根据1.2.5实验结果,运用Box-Behnken中心组合试验设计原理,以水解温度(X1)、水解pH(X2)、酶添加量(X3)为变量,水解度为指标,实验设计详见表1及表3。

表1 Box-Behnken试验设计Table 1 Design of Box-Behnken response surface experiments

式中,V3-样品体积,mL;c1-氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,mol/L;0.014-1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相当于氮的质量,g。

1.3 数据分析

数据处理与分析采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析与多重比较,以平均值±标准差表示;响应面实验由Design-Expert 8.0.5b设计并进行分析。

2 结果与分析

2.1 武定鸡胸肉基本成分分析

为计算蛋白酶的添加量(以鸡胸肉的干重计)和水解度，故测定鸡肉原料的水分含量和总氮含量，结果见表2。

表2 武定鸡胸肉基本成分Table 2 The basic ingredients of chicken meat

2.2 单一酶对鸡胸肉水解度的影响

2.2.1 单一酶添加量对鸡胸肉水解度的影响 由图1知,随着酶添加量增加,水解度增大,达到一定量后变化趋于平稳。其中,木瓜蛋白酶是水解度最大酶,在0.25%时,水解度最大,为26.49%,且与0.3%、0.35%添加量的水解度差异不明显(p>0.05);风味蛋白酶、动物蛋白酶和中性蛋白酶在添加量为0.3%时水解度达到最大,分别为8.65%、17.50%和22.37%,且与其他添加量的水解度相比,差异极显著(p<0.01),当添加量为0.35%时,水解度却有所下降。

图1 单一酶添加量对水解度的影响Fig.1 Effect of addition of single enzyme on DH

2.2.2 单一酶酶解时间对鸡胸肉水解度的影响 由图2可知,随着反应的进行,水解度逐渐增大,在反应5 h后趋于平缓,说明反应接近完成,反应5 h时,风味蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度分别为10.16%、18.53%、25.74%、18.94%。从实验结果分析可知,四种酶5 h水解度与3、3.5、4、4.5 h的水解度差异极显著(p<0.01),且与6 h的水解度差异不显著(p>0.05),说明底物在5 h内基本被酶解完全,而且酶解时间过长,会提高生产成本,因此适宜酶解时间为5 h。

图2 单一酶酶解时间对水解度的影响Fig.2 Effect of enzymatic time of single enzyme on DH

2.2.3 单一酶酶解温度对鸡胸肉水解度的影响 由图3可知,随着反应温度的升高,水解度先上升后下降。风味蛋白酶在50 ℃时水解度达到最大,水解度为10.43%,相比其他反应温度的水解度,差异极显著(p<0.01),而动物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在55 ℃时,水解度达到最大,分别为17.09%、26.49%、21.34%。其中,木瓜蛋白酶在55 ℃的水解度相比其他温度的水解度,差异极显著(p<0.01),中性蛋白酶在45～55 ℃之间,水解度差异不明显,但与60 ℃相比,差异极显著(p<0.01)。

图3 单一酶酶解温度对水解度的影响Fig.3 Effect of enzymatic temperature of single enzyme on DH

2.2.4 单一酶酶解pH对鸡胸肉水解度的影响 由图4可知,风味蛋白酶在pH为6.5时,水解度最大,为11.94%,而动物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度在pH为7.0时,达到最大,分别为20.52%、28.82%、24.84%。通过对实验数据进行分析可知,风味蛋白酶在pH为6.5时的水解度与pH为5.5、6.0、7.5时的水解度差异极显著(p<0.01),而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在pH为7.0时的水解度与pH为5.5、6.0、6.5、7.5时的水解度相比,差异极显著(p<0.01),动物蛋白酶在pH为7.0时的水解度与pH为5.5、6.0和6.5时的水解度相比,差异也极显著(p<0.01)。

图4 单一酶酶解pH对水解度的影响Fig.4 Effect of reaction pH of single enzyme on DH

通过以上实验,考察了酶添加量，酶解时间、温度和pH四个因素对水解度的影响,发现木瓜蛋白酶在四个因素实验中,水解度都是最高的,而中性蛋白酶次之,且与木瓜蛋白酶反应条件相似,在各个单因素实验中,最高的木瓜蛋白酶水解度大概是水解度最低的风味蛋白酶的3倍。木瓜蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶类,能水解甘氨酸、赖氨酸和精氨酸等的蛋白底物,中性蛋白酶属于金属蛋白酶类,能水解苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等的底物,两种酶复配,极大的增大了可水解的底物范围,且本研究以水解度为指标,发现木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解鸡胸蛋白的水解度明显高于其余两种蛋白酶,两种蛋白酶复配水解鸡胸肉蛋白的水解度明显高于单一酶水解,故选出木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行复配。

2.3 复配酶对鸡胸肉水解度的影响

2.3.1 复配酶复配比例对鸡胸肉水解度的影响 鸡胸肉蛋白质中的各种氨基酸含量是不同的,而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶所作用的氨基酸残基是不同的,因此,不同比例酶组合,水解度不同。由图5可知,酶复配比例在木瓜蛋白酶与中性蛋白酶比为2∶1时,水解度最大,为32.87%,通过实验数据分析发现,木瓜蛋白酶比中性蛋白酶为2∶1时的水解度与其余复配比例相比,差异极显著(p<0.01),因此,实验选择木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复配比例为2∶1。

图5 酶复配比例对水解度的影响Fig.5 Effect of the ratio of two enzymes on DH

2.3.2 复配酶添加量对鸡胸肉水解度的影响 由图6可知,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶添加量0.15%～0.375%时,水解度不断增大,且差异极显著(p<0.01),在0.375%时水解度最大,为36.92%。当酶添加量从0.375%增加到0.45%,水解度不再增加反而出现下降,且两者水解度差异极显著(p<0.01),当酶浓度过高时,可能还会不利于反应的进行,这可能是由酶的性质决定的,酶既能促进正反应,也能促进逆反应的进行,因此,酶的添加量要适可而止。

图6 复配酶添加量对水解度的影响Fig.6 Effect of addition of two enzymes on DH

2.3.3 复配酶酶解时间对鸡胸肉水解度的影响 由图7可知,当酶解时间由3 h增至5 h时,水解度明显增大,差异极显著(p<0.01),在5 h时,水解度达到了34.25%,当酶解时间由5 h增加到6 h时,水解度趋于平缓,差异也不显著(p>0.05),从实际成本及其他因素考虑,选择反应时间为5 h。

图7 复配酶酶解时间对水解度的影响Fig.7 Effect of enzymatic time of two enzymes on DH

2.3.4 复配酶酶解温度对鸡胸肉水解度的影响 由图8可知,当温度从45 ℃上升到55 ℃时,水解度逐渐增大,在55 ℃时水解度达到最大值,为34.38%,与45和50 ℃的水解度相比,差异极显著(p<0.01),温度继续升高,可能部分酶失去了活性,水解度降低,实验数据分析显示与温度为55 ℃时水解度相比,差异也是极显著的(p<0.01)。

图8 复配酶酶解温度对水解度的影响Fig.8 Effect of enzymatic temperature of two enzymes on DH

2.3.5 酶解pH对鸡胸肉水解度的影响 由图9可知,当pH由6.0上升到7.0时,水解度呈上升趋势,在pH为7.0时,达到最大值为31.77%,当pH超过7.0后,水解度又下降,结果显示pH7.0时的水解度与pH6.0、7.5时的水解度差异极显著(p<0.01),这结果是完全符合酶的特性,因为酶都具有一定适宜的反应pH,不适宜的条件都会影响酶的活性。

图9 复配酶酶解pH对水解度的影响Fig.9 Effect of reaction pH of two enzymes on DH

通过单一酶的单因素和复配酶的实验结果可知,复配酶解的效果要优于单一酶酶解,水解度随反应时间延长呈现先上升后平缓,且考虑到经济成本等原因,选择5 h,该因素不参与后续的响应面实验的优化,所以选择了温度、pH、酶添加量等三个因素进行优化实验。

2.4 响应曲面实验结果

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

注:“**”表示差异极显著，p<0.01。

表3 Box-Behnken实验方案及结果Table 3 Design and results of the response surface experiments

图10 温度与pH(A)、温度与酶添加量(B)和pH与酶添加量(C)交互影响鸡胸肉水解度曲面图Fig.10 Graph on interaction effect of reaction temperature and pH(A),reaction temperature and enzyme addition(B),pH and enzyme addition(C) on the degree of chicken breast hydrolysis

3 结论

在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken实验设计并通过响应面法优化修正后得到鸡胸肉最佳的酶解工艺条件为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加量分别为0.27%和0.13%,反应温度54.3 ℃,pH为6.8,在此条件下,反应时间5 h后,鸡胸肉酶解液的水解度达到了36.03%±0.31%,与预测值36.26%基本吻合,说明此方程与实际拟合较好,验证了此模型的合理性。

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OptimizationofenzymatichydrolysisprocessofYunnanWudingchickenbreastmeatbyresponsesurfacemethodology

SONGWu-gang1,2,WANGGui-ying1,2,CHENGZhi-bin2,GUDa-hai1,2,XUZhi-qiang1,2,ZHURen-jun1,*,LIAOGuo-zhou1,2,*

(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Provine,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

TS251.5+5

A

1002-0306(2017)18-0099-06

2017-02-07

宋武刚(1987-)，男，硕士研究生，研究方向：肉品加工与质量控制，E-mail:allens1987@126.com。

*通讯作者:朱仁俊(1968-)，男，硕士，教授，研究方向：食品安全与质量控制，E-mail:2421125021@qq.com。 廖国周(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：畜产品加工与质量控制，E-mail:liaoguozhou@ynau.edu.cn。

云南特色资源风味调料产品开发及产业化(2013IB010)；云南省科技计划项目重大科技专项(2016ZA008)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.020