4种提取工艺制备溃结康栓对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用

李丽霞，何 毅，马东明，马晓伟，裴 帅，夏鸿东，张懂懂，郑雪莹，黄芝娟*，肖学凤*

（1 .天津中医药大学中药学院，天津 300193；

2 .天士力制药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

4种提取工艺制备溃结康栓对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用

李丽霞1，何 毅2，马东明1，马晓伟1，裴 帅1，夏鸿东1，张懂懂1，郑雪莹1，黄芝娟2*，肖学凤1*

（1 .天津中医药大学中药学院，天津 300193；

2 .天士力制药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

目的 研究4种提取工艺制备的溃结康栓对2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导溃疡性结肠炎（UC）大鼠的治疗作用。方法 SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、美沙拉秦栓组和4种提取工艺制备的溃结康栓组共7组，每组10只，用TNBS法复制UC大鼠模型，各给药组给予相应栓剂治疗，连续14 d。以各组实验大鼠疾病活动指数（DAI）、结肠黏膜损伤度、组织病理学改变、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-4（IL-4）等为指标，对其治疗疗效进行评价。结果 模型组大鼠DAI评分、结肠黏膜损伤评分，血清中TNF-α、IL-1β及IL-4水平与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），美沙拉秦栓组、各工艺溃结康栓组DAI评分、结肠黏膜损伤评分显著降低，TNF-α、IL-1β 及IL-4水平与模型组比较有统计学意义（P＜0.05）；美沙拉秦栓组与工艺Ⅰ溃结康栓组、工艺Ⅳ溃结康栓组DAI评分，TNF-α、IL-1β及IL-4水平比较无统计学意义。结论 4种提取工艺制备的溃结康栓均对TNBS诱导的UC模型大鼠有治疗作用，其中以提取工艺Ⅳ制备的溃结康栓疗效尤为显著，可为溃结康栓制剂研究提供工艺基础。

溃结康栓；提供工艺；溃疡性结肠炎

Abstract: Objective To study effects of Kuijiekang suppository with four different processes on rats with ulcerative colitis induced by TNBS.Methods SD male rats were randomly divided into control group, model group,positive control group and four groups of Kuijiekang suppository with four different processes,10 rats per group.Rats model of ulcerative colitis set up by rectally administration of TNBS, except control group、model group, were given the appropriate medication to treat for 14 days.Take disease activity index, colon tissue injuries of scores, pathology,TNF-α, IL-1β, IL-4 as the detection indicator and evaluate the treatment.Results Compared with the control group,the model rats showed DAI significantly increased, the levels of TNF-α, IL-1βincreased (P＜0.01), and IL-4 decreased(P＜0.01).Compared with the model group, different processes and positive control group showed DAI significantly decreased (P＜0.05), the levels of TNF-α, IL-1βdecreased (P＜0.05), and IL-4 (P＜0.05) increased.Conclusion Kuijiekang suppositories with different processes rectly have effect on the ulcerative colitis induced by TNBS,especially in the first and the fourth process.Thus, the fourth process should be taken into consideration to conduct the next research.

Keyword: Kuijiekang suppository; process; UC

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因尚不明确的慢性、非特异性炎症性疾病，属炎症性肠病的一个主要类型。病变多位于乙状结肠和直肠，可扩展至近端结肠、横结肠甚至全结肠，溃疡严重者可侵及肌层及浆膜层，甚至导致肠穿孔。该病病程长、易复发、治愈难度大，被世界卫生组织列为现代难治病之一，严重威胁人类生存质量和健康水平，又有高癌变风险[1-2]。溃结康灌肠液是天士力制药集团股份有限公司开发的中药六类新药，由赤芍、青黛、炉甘石、白及等中药配制而成，治疗UC疗效显著[3-5]，但存在灌肠后药液肠容纳性低、患者依从性差等缺陷，在此基础上，笔者根据原处方及制剂工艺进行剂型改革，结合栓剂制备预实验、文献调研及以往的开发经验，优选4种工艺进行药效学研究，通过对UC大鼠的治疗作用评价，筛选出最佳的提取工艺，从而为溃结康栓制剂研究提供提取工艺基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠70只，雄性，体质量（200±20）g，动物许可证号：SCXK-（军）2012-0004，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.1.2 药品与试剂 美沙拉秦栓由实验室自制，美沙拉秦原料（湖北巨胜科技有限公司），硬脂酸聚烃氧（40）酯（S-40）（湖北远成赛创科技有限公司），5% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）（sigma公司），福尔马林由实验室配制，甲醛溶液，分析纯，批号20160111，天津市化学试剂供销公司，白介素-1β（IL-1β）Elisa试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）Elisa试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司），氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司）。

1.1.3 仪器 FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），栓剂模型（江苏省诸暨医药设备厂），L600台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），Infinite 200型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），DK-98-Ⅱ水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），远红外恒温干燥箱（余姚市远东数控仪器厂），Motic BA410 生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Motic Pro 282A-数码显微系统（麦克奥迪实业集团有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溃结康栓制备 工艺Ⅰ：赤芍等药材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；青黛、炉甘石等药材粉碎，均过100目药筛，混匀，制得药粉Ⅰ。工艺Ⅱ：赤芍、青黛、白及等药材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；炉甘石等药材粉碎，均过100目筛，混匀，制得药粉Ⅱ。 工艺Ⅲ：赤芍、白及等药材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；青黛等药材12倍量80 %乙醇提取2次，每次2 h；炉甘石粉碎，均过100目筛，混匀，制得药粉Ⅲ。工艺Ⅳ：赤芍等药材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；白及以水提醇沉方式制得白及粗多糖；青黛、炉甘石等药材过100目筛，混匀，制得药粉Ⅳ。4种药粉以S-40为基质，基质：药粉=1：1，制得4种栓剂，工艺Ⅰ溃结康栓、工艺Ⅱ溃结康栓、工艺Ⅲ溃结康栓，工艺Ⅳ溃结康栓。

1.2.2 实验分组 SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型组、美沙拉秦栓组、工艺Ⅰ溃结康栓组、工艺Ⅱ溃结康栓组、工艺Ⅲ溃结康栓组、工艺Ⅳ溃结康栓组共7组，每组10只。

1.2.3 大鼠UC模型的建立 1）TNBS乙醇溶液配制：5 % TNBS与50 % 乙醇体积比3：2混匀，4 ℃保存。2）UC大鼠模型的复制[6]：大鼠造模前禁食不禁水24 h，称重后，10 %水合氯醛溶液（3 mL/kg）腹腔麻醉，固定于手术台上，将外径2 mm、长约15 cm硅胶管于温水中浸泡至软，硅胶管外壁涂抹少许甘油，插入大鼠肛门6～8 cm，以TNBS乙醇溶液120 mg/kg（4 mL/kg）缓慢注入，夹闭肛门，倒置，使造模液充分作用于肠腔，正常对照组大鼠给予相同剂量的生理盐水灌肠。造模后大鼠侧卧归笼，自然清醒。造模后每天记录大鼠体质量、饮食、活动状态及粪便情况。

1.2.4 给药方法 于大鼠造模第3天后给药，放入自制固定容器内，使肛门完全暴露，给药。工艺Ⅰ溃结康栓组、工艺Ⅱ溃结康栓组、工艺Ⅲ溃结康栓组、工艺Ⅳ溃结康栓组给药剂量 4 mL/kg；美沙拉秦栓组给药剂量100 mg/kg，模型组与正常对照组给予4 mL/kg蒸馏水。给药前禁食不禁水12 h，用直径2 mm、长15 cm于温水中软化的硅胶管涂抹少量甘油后从肛门插入约6～8 cm，缓慢推入，给药后夹闭肛门，倒置。给药1次/d，连续14 d。

1.2.5 标本采集 给药后第14天晚禁食，次日对各组大鼠称重，10 %水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，腹主动脉取血，离心，取上清液，分装，- 20 ℃冰箱保存。迅速剖开肠系膜，分离肛门至盲肠之间的全部直肠和结肠，观察大鼠结肠6～8 cm外观形态，沿纵轴剖开肠管，用预冷的生理盐水冲洗肠管内残留物，平铺展开，肉眼观察黏膜病变情况，记录溃疡个数，直尺测量溃疡面大小。取1 cm大小的溃疡面，10 %福尔马林液浸泡固定，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色法（HE）染色，光镜下观察结肠的病理组织学形态。

1.3 检测指标 1 ）大鼠一般情况： 观察并记录各组大鼠精神状态、饮食、活动、毛色、大便性状、体质量等情况，各组大鼠进行DAI评分标准参照文献[7]。2 ）大鼠结肠黏膜损伤评分标准，参照文献[8-9] ：观察结肠黏膜大体形态损伤、组织病理学改变。3 ）生化指标测定：运用双抗体夹心ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-4 水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件，实验数据以均数 ±标准差（x± s ）表示，采用单因素方差分析进行各组间差异比较，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及DAI评分 正常对照组大鼠体质量正常增长，无腹泻、血便等异常改变。造模组大鼠在造模1 h后尿液颜色呈橘黄色，表明TNBS溶液已被吸收；造模组大鼠造模当天即出现精神不振、少动、厌食等表现；造、模后第2天即出现稀糊便，夹带脓血，1周内均伴有体质量下降，毛色无光泽、枯燥，少动等表现。4种提取工艺制备的溃结康栓组、美沙拉秦栓组随着给药时间的持续，症状明显好转，大便逐渐恢复正常，呈灰褐色颗粒状，毛色逐渐转为光亮顺滑。DAI评分结果,见表1。

表1 各组大鼠DAI评分（x± s ，n=6） 分

2.2 溃结康栓对UC大鼠病理形态学的影响 正常对照组大鼠结肠管壁无增厚，皱襞纹理清晰，黏膜光滑，镜下观察黏膜组织完整，细胞形态正常，黏膜固有层腺体排列整齐，含有大量的杯状细胞，无炎性细胞浸润。模型组大鼠结肠肠管局部充血、肠襞增厚，纤维化，失去弹性，可见明显水肿和溃疡，镜下观察结肠黏膜破坏，腺体结构紊乱，大量腺体被破坏消失，部分形成溃疡，隐窝消失，大量中性粒细胞浸润至黏膜下层、肌层，并且黏膜下层血管扩张、肌层增厚水肿。工艺Ⅰ溃结康栓组大鼠结肠黏膜仍见残缺断裂，杯状细胞增多，溃疡面情况改善，黏膜及黏膜下层中性粒细胞浸润减少，黏膜充血水肿。工艺Ⅱ、工艺Ⅲ溃结康栓组大鼠镜下观察结肠黏膜杯状细胞增多，仍可见隐窝脓肿，黏膜及黏膜下层有明显中性粒细胞浸润，与模型组相比，炎症侵犯的深度和范围减小。美沙拉秦栓组、工艺Ⅳ溃结康栓组大鼠结肠肠管轻度充血，未见水肿和溃疡，镜下观察结肠黏膜杯状细胞增多，腺体排列基本整齐，极少数仍见残缺断裂，少量中性粒细胞浸润。结肠黏膜大体评分结果，见表2。

表2 各组大鼠结肠黏膜损伤评分（x ± s , n=6） 分

2.3 溃结康栓对UC大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4的影响 见表3。

表3 各组大鼠血清中细胞因子水平比较（x± s , n=6）pg/mL

3 小结

从本实验的结果可知：与模型组比较，不同工艺溃结康栓组DAI评分、结肠黏膜损伤评分、血清中TNF-α、IL-1β水平显著降低，IL-4水平显著升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明不同提取工艺溃结康栓对UC大鼠有不同程度的治疗作用，其中工艺Ⅰ溃结康栓组和工艺Ⅳ溃结康栓组更为明显，但是由于提取工艺Ⅰ中白及以原药粉直接加入而制备溃结康栓，白及富含白及粗多糖，有特殊的粘性，在制栓过程中直接导致制栓液粘稠，注模困难。工艺Ⅱ、工艺Ⅲ溃结康栓组各指标差异较不明显，分析原因可能是溃结康复方臣药青黛、血竭中药效成分未被提取完全，而中药复方是由药物配伍共同发挥治疗作用，这也进一步提示对中药复方物质基础研究的必要性。综合以上结果，再结合实际生产条件，本课题选用工艺Ⅳ作为最佳提取工艺，以制备溃结康栓[10-12]。

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Therapeutic effect of Kuijiekang suppository with different processes on rats with ulcerative colitis induced by TNBS

LI Lixia1, HE Yi2, MA Dongming1, MA Xiaowei1, PEI Shuai1, XIA Hongdong1, ZHANG Dongdong1,ZHENG Xueying1, HUANG Zhijuan2*, XIAO Xuefeng1*
（1.School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;2.State Key Laboratory of Core Technology in Innovative Chinese Medicine,Tasly Pharmaceutical Group Co, Ltd, Tianjin 300410, China）

R283.1

A

2095-6258(2017)05-0708-04

2017-03-18）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.007

国家自然科学基金“中药质量战略研究”（81642011）。

李丽霞（1990 -），女，硕士研究生，主要从事药学专业方向研究。

* 通信作者：肖学凤，女，教授，硕士研究生导师，电话-（022）59596221，电子信箱-kai1219@163.com黄芝娟，女，高级工程师，电话-（022）86343778，电子信箱-huangzj@tasly.com