桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

张雪钰，武军凯，刘建珍，肖 啸，张立彬

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066600)

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

张雪钰，武军凯，刘建珍，肖 啸，张立彬*

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066600)

为确定桃树细胞质抗寒相关基因，依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因，结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp，编码513个氨基酸；结构域分析显示，该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域，是与拟南芥RBD1同源的蛋白；亚细胞定位预测表明，该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。

桃；抗寒性；叶绿体；ppRBD1；RRM

我国桃树栽培北线是北纬39°～40°地区，温度是限制其地理分布的主要因素，桃树在这些地区周期性发生冻害，给果树生产造成了严重的损失。实践证明，采用传统的育种手段很难解决这一问题。因此，研究抗寒性的相关基因并将其用于抗寒新品种的培育具有十分重要的意义[1]。目前，对于桃树抗寒性相关基因的研究主要集中在细胞核上。在桃上已经研究的比较清楚的有CBF冷诱导途径[2]、抗冻蛋白[3]等。对于桃树细胞质抗寒相关基因的研究鲜有报道。细胞质抗寒性的研究多集中在模式植物上。研究表明，定位于线粒体和叶绿体中的RNA结合蛋白与植物的抗寒性有关。Kim等[4]在拟南芥中发现一种定位于线粒体的甘氨酸富集RNA结合蛋白，在低温下含量显著提高。Wang等[5]通过T-DNA插入的方式筛选拟南芥中的冷敏感突变体，得到在抗寒方面具有重要作用的基因RBD1，该基因是细胞核编码的，而由其编码的蛋白质定位于叶绿体，是一种RNA结合蛋白，具有RRM基序。

模式植物细胞质抗寒相关基因的研究为桃树抗寒性的研究提供了重要理论依据。遗传学研究发现，抗寒与不抗寒亲本的正交与反交组合在F1代的抗寒程度的加权平均值具有显著差异[6]。笔者试图以桃为材料，通过生物信息学和分子生物学的方法克隆桃中与拟南芥抗寒性密切相关的同源PpRBD1基因，比较不同品种桃该基因的序列并进行相关的生物信息学分析，为进一步研究其功能和探索RNA结合蛋白对抗寒性的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

表1 6个桃品种抗寒性及来源

注：抗寒性强品种用“+”表示；抗寒性差品种用“-”表示。

选用3个抗寒性强桃品种和3个抗寒性差桃品种为试验材料。其中，中华寿桃、珲春桃和21世纪桃取自河北省秦皇岛市昌黎县河北科技师范学院园艺试验站，雪桃取自河北省保定市满城县苗圃场，怀来毛桃和早霞露桃取自北京农林科学院林业果树研究所(表1)。

pEASY-T5 Zero Cloning Kit，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell引自北京全式金生物技术有限公司。质量浓度20 g/L的CTAB裂解液，1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，5 mol/L NaCl，β-巯基乙醇，乙醇，冰乙酸引自北京博迈德公司。DNA胶回收试剂盒引自Axygen。其余试剂均为北京化工厂的产品(分析纯)。引物合成和测序工作由中美泰和生物技术有限公司完成。

1.2 DNA的提取

采用改良的CTAB法提取叶片DNA[7]。具体步骤如下：

(1)向已预冷的研钵中加入0.5 g幼叶，加入液氮进行充分研磨至粉末发白，立即用预冷的勺子转入已加入700 μL CTAB提取液(0.5 mmol/L EDTA，1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，20 g/L CTAB，体积分数为0.01的巯基乙醇)的1.5 mL离心管中。

(2)在漩涡振荡器上充分混合后65 ℃水浴60 min，水浴过程中不断轻轻晃动直至摇匀。

(3)加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻旋转摇动至充分混匀，室温下12 000 r/min离心10 min。

(4)上清液转移到另一离心管。

(5)重复步骤3和步骤4。

(6)加入2倍体积预冷的无水乙醇，上下轻轻翻转至充分混合，-20 ℃放置30 min后，12 000 r/min离心5 min，弃上清。

(7)得到的DNA沉淀用体积分数为0.70的乙醇冲洗3次后，再加入无水乙醇冲洗1次，吸干残存乙醇，超净工作台上晾干。

(8)干燥后加入100 μL RNase Free ddH2O水，弹起DNA使其充分溶解，-20 ℃保存备用。

1.3 目的基因的克隆

根据Wang等[5]的相关研究，搜索拟南芥中该RNA结合蛋白的编码基因(登录号：BT005155)，根据相近物种保守区域的序列，设计特异性引物。由于目标序列过长，分2段进行克隆测序。

P1:5’-GGAACTGACTCATTTTGCTCAGTAG-3’

P2:5’-TGCACTTTCTCATCAATCACTACC-3’

P3:5’-AGCAGGATGCAACTAGGTATGT-3’

P4:5’-GGGAAGAAGAGCATATTTCATTCAT-3’

对6个不同的桃品种进行PCR扩增。PCR扩增体系：①2×Es Taq MasterMix 10 μL,P1(10 pmol/L) 0.5 μL, P2(10 pmol/L) 0.5 μL, DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL, RNase Free ddH2O 8.5 μL；②2×Es Taq MasterMix 10 μL,P3(10 pmol/L) 0.5 μL, P4(10 pmol/L) 0.5 μL, DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL, RNase Free ddH2O 8.5 μL。

扩增程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，34个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保持[8]。

回收扩增片段并连接pEASY-T5载体，转化大肠杆菌感受态Trans1-T1。PCR鉴定阳性菌由中美泰和生物技术有限公司进行测序。

1.4 生物信息分析

利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序进行序列比对，并寻找同源基因和蛋白序列[9]。

利用DNAMAN软件进行桃不同品种的核酸序列拼接、分析和多序列比对。

利用ExPASy网站(http://www.expasy.org/)的在线工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对蛋白质的分子量和理论等电点进行分析[10]。

利用LOCASIZER 1.0网站(http://localizer.csiro.au/)进行蛋白质的亚细胞定位。

蛋白质序列预测，并利用NCBI网站的CDD在线分析软件对蛋白质保守结构域进行预测。

利用SWISS-MODEL在线分析工具(https://swissmodel.expasy.org/)对保守结构域进行三级结构预测。

利用MEGA5对13个物种的RNA结合蛋白进行进化树的构建，各蛋白氨基酸的比对在ClustalW上进行。进化树的构建使用邻接法(Neighbor-Joining)进行，并用Bootstrap进行可靠性检验，重复次数设为500，其它参数选择默认值。

2 结 果

2.1 RBD基因的克隆

通过PCR扩增，得到两段PCR扩增产物，引物P1和P2的PCR扩增产物约1 000 bp，引物P3和P4的PCR扩增产物约1 500 bp(图1)。将测得的序列拼接分析，得到2 230 bp的序列，将其提交到NCBI数据库(登录号：KY744742)。

2.2 RBD基因及其编码蛋白的生物信息学分析

2.2.1RBD基因序列的BLAST结果 利用NCBI网站的BLAST进行序列比对，得到桃假定蛋白的mRNA序列(登录号：XM_007222655)，全长819 bp与本实验的部分序列一致。通过编码蛋白序列的预测分析，该序列与NCBI中的桃假定蛋白(登录号：ONI30572.1)的氨基酸序列高度相似(图2)。

图1 PCR产物电泳结果

图2 PpRBD1基因结构示意图

2.2.2不同桃品种比较 用DNAMAN对6个桃品种进行基因序列和翻译氨基酸序列的比较，发现珲春桃、21世纪桃、雪桃和早霞露桃在基因序列上与假定蛋白的mRNA完全一致。与这些品种的基因序列相比，中华寿桃和怀来毛桃在外显子1区域的①158 bp(T→G)，②280 bp(A→C)，③465 bp(A→G)等3位点和内含子2区域的④1 063 bp(T→A)以及外显子3区域的⑤1 325 bp(C→T)和⑥1 761 bp(G→A)有单碱基差异。对应的氨基酸在①52位(L→W)、②93位(A→C)和③305位(T→I)有单个氨基酸的差异。④位于内含子区域，不编码氨基酸，③和⑥处氨基酸发生简并。结果表明，该基因在同一物种中保守性较强。2.2.3理化性质分析 利用ExPASy网站的ProtParam对PpRBD1编码蛋白的理化性质进行了分析[11]。结果表明，该蛋白的理论分子量为56.547 kD，理论等电点为5.23，分子式为C2465H3956N678O815S13，脂肪族氨基酸指数74.09，亲水性平均系数(GRAVY)-0.675，可能为亲水性蛋白。不稳定系数44.61，根据Guruprasad方法表明该蛋白为不稳定蛋白。2.2.4LOCALIZER1.0蛋白质亚细胞定位预测 LOCALIZER 1.0是一种基于叶绿体和线粒体的转运肽以及细胞核的NLSs(nuclear localization signals)特征预测蛋白的亚细胞定位的工具[12]。植物细胞中有许多由细胞核基因编码的，在不同的细胞区室执行特定功能的蛋白质，这些蛋白质往往具有专门的转运肽。预测结果显示，PpRBD1基因编码的氨基酸序列中，1～28位为cTP(chloroplast transit peptides，叶绿体转运肽)，可信度0.919；还有2个NLS。

2.2.5CDD鉴定 利用DNAMAN对拟南芥RBD1基因和桃的PpRBD1基因编码的蛋白序列进行比对，氨基酸全序列相似性仅32.43%，但是202～288位相似性达71.26%。

选择保守性较高的区域，利用NCBI中的CDD工具对保守结构域进行预测。鉴定结果显示，该基因编码的蛋白在202～288位具有RRM结构域，可能属于RRM超家族。

2.2.6预测蛋白的保守结构域的SWISS-MODEL同源建模 利用SWISS-MODEL对该基因的预测蛋白保守结构域进行同源建模，在202～288位得到预测的三维结构(图3)。该结构为β折叠和α螺旋形成的β1α1β2β3α2β4三明治结构，空间上4个反向平行的β折叠按照β4β1β3β2的顺序排列，与RRM结构域一致[13]。

2.2.7进化树的构建 利用MEGA5软件，通过构建RNA结合蛋白与其他生物中相关蛋白的系统进化树，以拟南芥作根，构建有根树(图 4)。发现该蛋白的进化与生物演化的方向一致，近源物种的遗传距离较近，远源物种的遗传距离较远，与桃(prunuspersica)同属蔷薇科的prunusmume、Malusdomestica和Fragariavesca在同一分支上。表明这些蛋白具有相同的起源，在生物漫长的演化过程中，在不断地趋异进化。

图3 RRM保守结构域三维结构预测

图4 8个物种RNA结合蛋白进化树

3 讨 论

植物响应低温胁迫的主要形式之一是通过形成稳定的RNA二级结构实现的[14]。RNA结合蛋白与低温胁迫的关系研究最早见于对大肠杆菌冷激蛋白(CSP)的报道中。大肠杆菌CSP在低温胁迫下产生RNA结合蛋白，这些蛋白的三级结构包含两个RNA冷激结合域(CSD)。低温诱导下，mRNA和CSP蛋白水平升高，CSD和RNA结合，解开双链DNA[15]。

植物上有些RNA结合蛋白对低温诱导同样有重要的作用。Kim等[4]研究表明在低温胁迫下，拟南芥AtGRP2的含量显著提高，有助于提高植物的抗寒性。该蛋白是甘氨酸富集RNA结合蛋白，定位于线粒体上。Kim等[16]研究拟南芥的RZ-1a，发现在低温胁迫下其含量显著提高。Wang等[5]对拟南芥的T-DNA插入的冷敏感突变体进行了筛选和研究，鉴定出一种RNA结合蛋白(暂命名为RBD1)基因缺失的突变体在低温胁迫下与野生型的抗寒性表现出差异。该基因定位于细胞核，为组成型表达，但是其编码的RBD1蛋白定位于叶绿体，结合23S rRNA前体的3个结构域，并且在低温下结合能力更强。因此，RBD1蛋白作用于23S rRNA的前提而影响叶绿体内蛋白质的翻译过程。

拟南芥中的RBD1蛋白具有538个氨基酸残基，并含有一个RNA识别基序。RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM)，又称为RNA结合结构域(RNA-binding domain,RBD)或核糖体蛋白结构域(ribonucleoprotein domain,RNP)，在生物界中广泛存在，包括原核生物和病毒，但是在真核生物中丰度最高，是真核生物最丰富的蛋白质结构域之一[13]。在植物中，RRM蛋白存在于叶绿体，参与叶绿体mRNA 3’末端的加工[17]。植物线粒体中也有发现，但是功能还不清楚[18]。

本次研究克隆桃基因组得到的PpRBD1基因经过生物信息学分析，结果显示该基因编码的蛋白由513个氨基酸残基组成，具有RRM基序。根据模式植物拟南芥中相关的研究结论和蛋白质亚细胞定位预测的结果，推测该基因编码的蛋白由细胞核基因编码后，表达在叶绿体中，在低温下可能参与23S rRNA的剪切过程，进而影响叶绿体内蛋白质翻译的正常进行。

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(责任编辑：朱宝昌，陈于和)

Abstract: The objective of this study was to clone a novel chloroplast gene ofPpRBD1 in peach (Prunuspersica) according toArabidopsisthalianaand peach genome data, and to analyze its correlation with cold tolerance. The full length ofPpRBD1 gene was 2 230 bp sequence, which encoded a deduced protein including 513 amino acid residues. The domain analysis revealed that the amino acid sequence contained a conserved RRM (RNA recognition motif) domain, which was a protein homologous to RBD1 inArabidopsisthaliana. Subcellular localization showed that it expressed possible in chloroplast. And it might play an important role in plant tolerance.

Keywords: peach (Prunuspersica); cold tolerance; chloroplast;PpRBD1; RRM

CloningandCharacterizationofaNovelChloroplastGenePpRBD1AssociatedwithColdToleranceinPeach(Prunuspersica)

ZHANG Xueyu, WU Junkai, LIU Jianzhen, XIAO Xiao, ZHANG Libin

(College of Horticulture Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

S662.1

A

1672-7983(2017)02-0012-06

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.02.003

国家自然科学基金资助项目(项目编号：31572093)。

*通讯作者，男，教授，硕士，硕士研究生导师。主要研究方向：桃遗传育种与分子生物学。E-mail:zhanglibin9364@163.com。

2017-05-08;修改稿收到日期2017-06-05

张雪钰(1992-)，女，硕士研究生。主要研究方向：果树遗传育种与分子生物学。