电针对足三里穴位局部细胞外电离子浓度的影响

张广健,高蕊,刘群峰,崔红纓,崔延超,付军科



电针对足三里穴位局部细胞外电离子浓度的影响

张广健1,高蕊1,刘群峰2,崔红纓1,崔延超1,付军科1

(1.西安交通大学第一附属医院,西安 710061;2.西安交通大学航空航天学院,西安 710049)

目的 观察生理状态下电针对穴位局部细胞外电离子浓度的影响,为探索电针穴位的作用机制提供依据。方法 选取雄性SD大鼠20只,电针大鼠足三里穴60 min(1 mA,0.2 ms,2 Hz),同时采用微透析仪于足三里穴位局部以及非穴位部位收集组织液。分子探针膜部分采样共收集4 h,电针前生理状态60 min、电针时60 min、电针后60 min以及电针后120 min。对所得样品采用电解质分析方法进行即时分析,观察足三里局部Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl-离子的浓度变化。结果 足三里穴位局部Ca﹢﹢离子浓度在电针时出现显著升高(=0.003 vs电针前),此后逐步上升,至电针后60 min时穴位局部Ca﹢﹢浓度到达高峰(=0.75 vs电针时)。至电针后120 min Ca﹢﹢离子浓度出现下降,与电针时比较差异有统计学意义(=0.04)。穴位局部细胞外Na﹢及Cl﹣离子浓度在电针时亦出现显著升高(＜0.001,=0.007 vs电针前)。电针后即逐步下降,至电针后60 min下降至(71.81±15.09)mmol/L与(57.42±14.30)mmol/L(=0.09,=0.07 vs电针时)。所测穴位处细胞外K﹢浓度水平表现出与Na﹢、Cl﹣类似的趋势,但差异不具有统计学意义。电针刺激可使非穴部位细胞外Ca﹢﹢、Na﹢、K﹢以及Cl﹣离子浓度出现轻度升高,但是同电针前相比未见显著性差异(＞0.05 vs电针前)。结论 电针刺激大鼠足三里可诱导穴位局部细胞外Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl﹣离子浓度出现明显升高,电离子浓度在电针后不同时程出现下降。这为研究电针治疗生理机制提供了实验基础。

电针;穴,足三里;细胞外电离子,穴位局部

目前电针穴位在国内外临床治疗中已获得广泛应用[1]。研究认为电针过程中穴位局部的变化很可能是探索其作用机制的有效切入点[2-3]。电针可能通过增加穴位局部细胞膜的离子通透性、加快通道激活速度,引起穴位局部电离子、神经递质等的浓度出现改变[4-6]。而由离子浓度改变诱发的电通讯变化,被认为是引起神经末梢和细胞之间通讯改变的关键原因,是电针产生治疗效果的生理基础[7-8]。因此观察电针对穴位局部的离子浓度的作用规律及特点,将为深入揭示电针的作用机制提供重要信息。本研究以电针为干预方式,采用微透析技术获取穴位局部组织液,观察电针对穴位处细胞外离子浓度的影响,从电离子角度为电针治疗机制提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠20只,体质量(200±20)g,饲养环境温度维持在(22±3)℃和12 h光/暗周期下,自由进食和饮水,适应性喂养1星期。实验是根据学校的机构动物护理委员会的指导方针进行的,所有的努力都是为了尽量减少使用动物的数量和它们的痛苦。

1.2 腧穴定位及电针

腧穴定位参考《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位之大鼠常用针灸穴位[9]。足三里穴在大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm。旁开非穴点[10]在大鼠腓骨头下方凹陷中的阳陵泉穴与足三里穴连线的中点,为旁开非经非穴对照点。

大鼠套筒固定,有小孔前端通风,后肢通过2个后孔扩展。电针为直径0.25 mm不锈钢针,弯曲成一个“L”的形状。电针近端由导线连接到电刺激器(HANS LH800,北京大学,中国),产生双相方波。远端插入大鼠足三里穴位,针刺深度为3 mm。电针时长为60 min (1 mA,0.2 ms,2 Hz),以大鼠下肢轻度抖动为宜[11]。

1.3 微透析操作步骤

微透析取样采用CMA 30 Linear微透析探针(CMA Microdialysis,Stockholm,Swede),探针直径0.24 mm,全长21 cm,透析膜长度10 mm。所用微量注射泵为CMA 100(CMA Microdialysis,Stockholm,Sweden)。分子探针膜部分采样开始前浸入蒸馏水30 min。首先将微透析透析膜部植入足三里穴位(或非经非穴部位)局部肌肉组织中(深度约1 mm),随后由入口管以2mL/min速度泵入蒸馏水,平衡30 min后开始正式收集组织液(图1)。每60 min收集得一个样品,共收集4 h,即电针前60 min、电针时60 min、电针后60 min以及电针后120 min[12]。

注:在电针同时,进行足三里穴位以及非经非穴部位细胞外组织液取样。Inlet为入口管;Outlet为出口管

1.4 电离子浓度测量

采用Hitachi LABOSPECT008分析系统对样品中Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl-离子浓度进行测量。采用体外回收率检测方法对探针回收率进行检测[13]。用微透析仪对已知浓度电离子标准品溶液进行透析,检测透析液浓度,探针回收率=测得电离子浓度/己知标准品浓度。体内电离子浓度=测得电离子浓度/探针回收率[14]。

1.5 统计学方法

采用SPSS17统计软件,数据用均数±标准差表示。组间比较采用非配对检验,当方差不齐时选择-检验。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 探针回收率

到目前为止,体外标准浓度与透析液浓度的比例是测定透析液回收率的标准方法[13-14]。研究体外测得标准溶液Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢、Cl﹣电离子浓度及透析液的浓度,探针回收率如表1所示。

表1 探针回收率的测定 (±s)

表1 探针回收率的测定 (±s)

电离子标准液浓度实测浓度回收率/% Ca﹢﹢8.52±0.085.74±0.7267.40 Na﹢40.90±0.2723.40±0.7057.21 K﹢25.21±0.1314.54±1.7557.68 Cl﹣26.42±0.3315.85±0.7661.22

2.2 细胞外电离子浓度测定

电针穴位局部Ca﹢﹢离子浓度在电针后出现显著升高(=0.003,vs电针前),此后逐步上升,至电针后60 min时穴位局部Ca﹢﹢浓度到达高峰(=0.75,vs电针时)。至电针后120 min Ca﹢﹢离子浓度出现下降,与电针时比较差异有统计学意义(=0.04,见表2),但仍显著高于电针前穴位局部Ca﹢﹢离子浓度水平。

穴位局部细胞外Na﹢及Cl﹣离子浓度在电针时亦出现显著升高(＜0.001,=0.007 vs电针前)。此后即逐步下降,至电针后60 min下降至(71.81±15.09)与(57.42±14.30)(=0.09,=0.07 vs电针时,见表2)。所测穴位处细胞外K﹢浓度水平表现出与Na﹢、Cl﹣类似的趋势。电针刺激使得穴位处细胞外K﹢浓度出现上升,但与电针前相比未见显著差异(=0.43)。此后逐步下降,至电针后120 min K﹢浓度为(3.14±1.09) (=0.04 vs电针时,见表2)。电针非穴部位后,局部组织细胞外Ca﹢﹢及K﹢后离子浓度出现轻度升高(=0.61,=0.47 vs电针前),随后即逐步下降。同穴位局部反应不同,电针刺激使得非穴部位Na﹢及Cl﹣离子浓度逐步下降,但是同电针前相比未见显著性差异(=0.23,=0.35 vs电针前,见图2)。

表2 电针对穴位局部细胞外电离子浓度影响 (±s)

表2 电针对穴位局部细胞外电离子浓度影响 (±s)

电离子电针前60 min电针时60 min电针后60 min电针后120 min Ca﹢﹢0.16±0.110.36±0.161)0.40±0.151)0.21±0.112)3) Na﹢51.53±9.3578.43±11.831)71.81±15.091)66.29±12.84 K﹢3.93±1.414.46±1.553.28±1.303.14±1.093) Cl﹣45.95±10.0461.11±12.351)57.42±14.3048.26±13.063)

注:与电针前60 min比较1)＜0.05;与电针时60 min比较2)＜0.05;与电针后60 min比较3)＜0.05

图2 非经非穴部位细胞外电离子浓度对比

3 讨论

生物体作为一个开放的复杂系统,是由无数个大小网络相互联系-整合而形成的。从穴位刺激到机体效应,两者之间并不是直线性联系,而是由体内复杂网络调节系统介导的[5]。针刺穴位局部就存在一个能将针刺物理信息转化为生物信息的启动网络。研究认为,离子通道和促离子型受体能直接调节神经系统的兴奋性,是启动网络中的重要成员[7]。针刺刺激离子通道具有广泛的生物学活性,是开启机体神经-内分泌-免疫网络调节的重要因子[8]。本研究首次对穴位局部的多种电离子,包括Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl﹣的浓度进行了同步观察,发现足三里穴位局部不仅存在Ca﹢﹢富集,其K﹢、Na﹢以及Cl﹣含量亦明显高于非穴部位。提示经络腧穴信号传导应是多种电离子共同作用的结果,对穴位作用的解释应考虑多种电离子交叉作用的影响[15]。

微透析是一种从生物活体内进行动态微量生化取样的技术。该取样技术最大的优势是在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时取样,特别适用于研究在体动态变化[16]。近年周新异等[10]、潘萍等[17]将微透析法应用于针刺效应与经络活动的研究中,结果表明该方法能在保持动物新陈代谢正常进行的情况下进行取样,在真实反映针刺对动物影响方面具有应用优势。此次我们即采用微透析法对穴位局部以及非穴部位的细胞外电离子浓度进行测量,结果表明探针的回收率可达57.21%～67.40%,这优于既往报道[10],可能与研究中进行微透析时所采用的不同采集参数有关。

自上世纪90年代起,人们发现有穴位局部Ca﹢﹢的富集现象,推测Ca﹢﹢可能是经络腧穴治疗的关键物质[18-20]。刺激穴位能显著增加血液中的Ca﹢﹢含量,降低尿中钙/肌酐比值,进而影响靶器官功能[21]。当络合Ca﹢﹢或阻断Ca﹢﹢活动的相应环节后,针刺效应即受到很大的影响[22]。这些研究提示针刺效应与穴位Ca﹢﹢浓度改变间存在密切关系,Ca﹢﹢可能在针刺网络信号的调控过程中起到了极其重要和广泛的作用,是针刺网络调节效应的重要节点[7]。此次我们采用微透析技术动态观察电针对穴位部位细胞外Ca﹢﹢浓度进行在体动态观察,发现电针能引起穴位局部Ca﹢﹢离子浓度出现显著升高,且该效应持续至电针120 min后Ca﹢﹢离子浓度始出现下降,但穴位局部Ca﹢﹢浓度仍显著高于电针前水平。我们考虑这种效应产生的原因可能是穴位处受针刺刺激后引起局部结缔组织牵张,释放Ca﹢﹢至细胞间隙[23];电针刺激增强细胞膜的通透性,促使Ca﹢﹢从细胞内进入细胞外[24];外加电场可引起细胞膜去极化或超极化,产生动作电位,导致Ca﹢﹢外流[25]。本研究同时对非穴部位进行观察,发现电针非穴部位仅使得局部Ca﹢﹢浓度轻度升高,随后即逐步下降,提示这种电针刺激引起的Ca﹢﹢浓度的显著升高是穴位特异性的。这种电针引起的穴位局部Ca﹢﹢浓度持续性升高,不仅可以引起肌肉收缩,促进神经元放电,还可激活肥大细胞,促使肥大细胞脱颗粒[8,23]。而研究人员早在50年代就发现过敏介质组胺的释放需要Ca﹢﹢的存在,认为Ca﹢﹢是组胺释放的必需条件。这种Ca﹢﹢浓度升高诱发的多种神经内分泌系统介质的相互作用,被认为是最终作用于靶器官,发挥针灸调节作用的关键步骤[26-27]。

正常组织中,细胞内外Na﹢和K﹢存在着显著的离子梯度,为维持细胞的电位起着非常重要的作用[4-5]。电针刺激穴位可能对细胞内外Na﹢和K﹢含量产生影响,通过改变细胞膜Na﹢和K﹢通道激活速度与细胞电位,影响邻近细胞功能。研究发现,艾灸足三里可使得局部K﹢浓度在灸后60 min时显著升高,考虑艾灸引起的K﹢通道功能改变亦是艾灸发生效应的始动环节之一[10]。本研究发现电针后穴位局部组织液中随着Ca﹢﹢浓度增高,Na﹢和K﹢含量亦出现明显升高。此后随着升高的Na﹢和K﹢浓度回落,细胞间隙内Ca﹢﹢浓度也在电针后120 min逐步下降。我们推测电针刺激中针刺牵拉刺激作用外加电场影响,使得Na﹢和K﹢通道电流增加,引起Na﹢和K﹢大量外流。而这种电针打破穴位局部稳态,引起Na﹢和K﹢通道功能开放,可能进一步加快Ca﹢﹢通道激活速度,从而促进细胞内Ca﹢﹢持续加速外流。我们考虑这种多种电离子浓度改变的交互作用可能是电针穴位治疗的生理基础,但其具体作用机制有待进一步研究。下一步我们将对电针穴位局部电离子相关通道的影响进行探索。

[1] 朱丹,白洁静,张晓庆,等.电针参数定量化的研究进展[J].中国针灸,2015,35(5):525-528.

[2] 肖阳,韩颖,杨赵栋.电针对佐剂性关节炎大鼠病灶局部CRH阳性细胞免疫反应性的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2006,(5):517-522.

[3] 白良川,许冠荪,张荣军,等.电针对兔激素性股骨头坏死局部组织血流量的影响[J].安徽中医学院学报, 2004,23(1):33-34.

[4] Yang ES, Li PW, Nilius B,. Ancient Chinese medi- cine and mechanistic evidence of acupuncture physiology[J].,2011,462(5):645-653.

[5] Deng QS, Fang ZC, Yin Y. Ionic mechanism of acupunc- ture on improvement of learning and memory in age mammals[J]., 1995,23(1):1-9.

[6] 王秀云,郭义,徐汤苹.针刺镇痛的外周经穴离子机理研究[J].针刺研究,1998,23(4):263-265.

[7] 邓亲恺,殷平善,王升旭,等.寻找实现经络生理调控功能的信息载体-兼论经络本质研究的新途径[J].中国针灸,2003,23(10):605-608.

[8] 陈波,李明月,郭义,等.肥大细胞源性外来体参与构建针刺穴位效应启动小网络的探讨[J].针刺研究,2015, 40(1):82-85.

[9] 张露芬.实验针灸学[M].北京:化学工业出版社,2010: 219-221.

[10] 周新异,刘娟,吴巧凤,等.不同状态下艾灸对穴位局部细胞外钾离子浓度的影响[J].中国针灸,2014,34 (1):61-65.

[11] Rui G, Guangjian Z, Yong W,. High frequency electro-acupuncture enhances striatum DAT and D1 receptor expression, but decreases D2 receptor level in 6-OHDA lesioned rats[J].,2013,237: 263-269.

[12] Nagaoka S, Shinbara H, Okubo M,. Contributions of ADP and ATP to the increase in skeletal muscle blood flow after manual acupuncture stimulation in rats[J]., 2016,34(3):229-234.

[13] 张树栋,闰龙涛,林雨青,等.微透析技术实时检测肾热缺血后葡萄糖变化的动物实验研究[J].中国微创外科杂志,2009,9(3):225-229.

[14] Huang SH, Zhang J, Li Y,. Time Delay of Microdial- ysis in vitro[J]., 2013,5(2):149-152.

[15] 陈知水,杨萍,陈旭阳,等.经络系统-人体生物电离子通路网络的探讨[J].亚太传统医药,2006,2(2):49- 53.

[16] Luo T, Guo Y. Specificity study on concentration of monoamine transmitters at acupoint and effect of acupuncture on its distribution[J]., 2014:704507.

[17] 潘萍,郭义.针刺对家兔组织液内HA及5-HT含量影响的实验研究[J].辽宁中医杂志,2013,40(4):775-777.

[18] 郭义,徐汤苹,陈进生,等.家兔经穴钙离子浓度特异性的研究[J].针刺研究,1991,16(1):66.

[19] Gao J, Zhao Y, Wang Y,. Anti-arrhythmic effect of acupuncture pretreatment in the rats subjected to simulative global ischemia and reperfusion-- involvement of intracellular Ca2﹢and connexin 43[J]., 2015,15:5.

[20] Li G, Liang JM, Li PW,. Physiology and cell biology of acupuncture observed in calcium signaling activated by acoustic shear wave[J]., 2011, 462(4):587-597.

[21] 景丹丹,李忠仁.钙离子生物活性与针刺调节作用的研究进展[J].北京中医药,2008,27(8):663-665.

[22] 陈静子,郭义,郭永明,等.络合足三里穴区Ca2﹢对针刺大鼠足三里穴背根神经细束放电影响的研究[C].中国针灸学会年会论文集,2011:1-11.

[23] 白杨,郭义.针刺效应/信号调节网络初探[J].针刺研究,2013,38(4):330-333.

[24] 林栋.对穴位-针刺效应研究现状的思考[J].中国针灸, 2011,31(11):1049-1051.

[25] McCaig CD, Rajnicek AM, Song B,. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential[J]., 2005,85(3):943-978.

[26] 何伟,吴美玲,景向红,等.穴位的本态:穴位组织细胞化学的动态变化[J].中国针灸,2015,35 (11):1181-1186.

[27] 潘萍,郭义.肥大细胞是针刺效应信号放大的关键因素之一[J].辽宁中医杂志,2009,36(12):2066-2068.

Effect of Electroacupuncture on Local Extracellular Ionized Atom Concentrations at Point Zusanli (ST36)

-1,1,-2,-1,-1,-1.

1.’,’710061,; 2.’,’710049,

Objective To investigate the effect of electroacupuncture on acupoint local extracellular ionized atom concentrations under physiological status and provide a basis for exploring the mechanism of action of electroacupuncture. Method Twenty male SD rats were selected. Rat point Zusanli (ST36) was given electroacupuncture (1 mA, 0.2 ms and 2 Hz) for 60 min. Meanwhile, local tissue fluid was collected at point Zusanli and non-acupoints using a microdialyzer. The collection by molecular probe membrane sampling lasted 4 hrs: 60 min physiological status before electroacupuncture, 60 min electroacupuncture, 60 min after electroacupuncture and 120 min after electroacupuncture. Real-time analysis of the sample was made by electrolyte analysis to observe local changes in concentrations of Ca﹢﹢, K﹢, Na﹢and Cl-at point Zusanli. Result Local Ca﹢﹢concentrations at point Zusanli increased significantly during electroacupuncture (=0.003, vs before electroacupuncture), rose gradually afterwards and reached the peak at 60 min after electroacupuncture (=0.75, vs during electroacupuncture). Ca﹢﹢concentrations decreased at 120 min after electroacupuncture; there was a statistically significant difference compared with during electroacupuncture (=0.04). Acupoint local extracellular concentrations of Na﹢and Cl-also increased significantly during electroacupuncture (＜0.001,=0.007, vs before electroacupuncture) but decreased gradually during 60 min after electroacupuncture and to (71.81±15.09) mmol/L and (57.42±14.30) mmol/L, respectively, at 60 min after electroacupuncture (=0.09,=0.07 vs during electroacupuncture). Acupoint extracellular K﹢concentrations had a tendency similar to those of Na﹢and Cl-but there was no statistically significant difference. Non-point electroacupuncture slightly increased extracellular concentrations of Ca﹢﹢, K﹢, Na﹢and Cl-but there were no statistically significant differences compared with before electroacupuncture (＞0.05). Conclusion Rat point Zusanli electroacupuncture can induce significant increases in acupoint local extracellular concentrations of Ca﹢﹢, K﹢, Na﹢and Cl-. Ionized atom concentrations decrease in different degrees after electroacupuncture. These provide an experimental basis for studying the physiological mechanism of electroacupuncture treatment.

Electroacupuncture; Point, Zusanli (ST36); Extracellular ionized atom; Local acupoint

1005-0957(2017)08-0999-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.08.0999

2017-02-20

国家自然科学基金项目(81302917)

张广健(1979—),男,副主任医师,博士,Email:michael8039@163.com

高蕊(1980—),女,副主任医师,博士,Email:jacky_mg@163.com