微波消解-ICP-MS法测定青海和西藏产区冬虫夏草中的35种元素

张敏敏，赵恒强，赵志国，刘伟，刘倩，梁琰，耿岩玲，黄璐琦，王晓*

(1. 山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2. 中国中医科学院中药资源中心，道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院，北京 100700)

【中药与天然活性产物】

微波消解-ICP-MS法测定青海和西藏产区冬虫夏草中的35种元素

张敏敏1，赵恒强1，赵志国1，刘伟1，刘倩1，梁琰1，耿岩玲1，黄璐琦2，王晓1*

(1. 山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2. 中国中医科学院中药资源中心，道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院，北京 100700)

为了测定青海和西藏产区的17批冬虫夏草中的35种元素(其中16种为稀土元素)的含量，并进行初步产地鉴别分析，运用微波消解-ICP-MS法测定了3批玉树、4批那曲和10批果洛产区的虫草样本，并对3个产区的测定结果进行聚类分析。结果表明，不同产区的虫草药材各种元素含量差别较大，本文对其中4种有害元素Cd, Pb, As, Cu推荐了限量标准；聚类分析结果表明，玉树和果洛产区聚类较近、差异性较小；那曲产区聚类较远，相对差异性较大。该方法快捷、准确、可行性强，为不同产地冬虫夏草药材的质控和用药安全指导提供了理论依据。

ICP-MS; 冬虫夏草；微量元素；稀土元素

Abstract∶To determine the contents of 35 elements (including 16 rare earth elements) in 17 batches of Chinese caterpillar fungus from Qinghai and Tibet and make preliminary identification analysis of their habitats, a total of 35 elements in Chinese caterpillar fungus samples were determined by microwave digestion-ICP-MS, including 3 batches from Yushu, 4 batches from Naqu and 10 batches from Guoluo. Furthermore, cluster analysis was carried out on the measurement results of 3 producing areas. Results showed that the contents of 35 elements in 17 kinds of Chinese caterpillar fungus samples from different origins have obvious differences. And the limits of the 4 kinds of harmful elements (Cd, Pb, As and Cu) were recommended. The results of cluster analysis showed that the samples from Yushu and Guoluo were close, and the difference was small, while the sample from Naqu was far away, and its relative difference was larger. This method is quick, accurate and feasible, which provides a theoretical basis for quality control and medication guidance of Chinese caterpillar fungus from different habitats.

Key words∶ICP-MS;Chinese caterpillar fungus; trace elements; rare earth elements

冬虫夏草又称虫草，为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(Berk. ) Sacc. 寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1]。冬虫夏草作为我国传统珍贵滋补类中药，具有调节免疫，抗肿瘤，抗疲劳，调节心脏、肝脏、呼吸系统等多种功效[2]。我国冬虫夏草主要产于西藏和青海的高山地区[3]。现代药理学研究表明，冬虫夏草含有多糖、核苷、氨基酸、糖醇、甾醇、脂肪酸等多种化学成分[4-5]。另外，虫草中还含有Na、Mg、K、Go、Ce、Nd、Er等多种元素[6-7]。这些元素的含量存在产地差异，对冬虫夏草的品质具有很大影响。因此，为保证用药安全、有效，对虫草中元素含量的测定具有重要意义。

在中药微量元素研究中，离子光谱法、分光光度法、离子选择电极法、微分电位溶出法、催化示波极谱法、中子活化分析法、能量色散射线分析法、冷蒸气原子吸收光谱法、原子荧光法、分子荧光法以及加压消解-原子吸收光谱法等多种方法被不断改进和应用[8]。其中，电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS)以其高灵敏度、高精密度、高稳定性和低检出限等优点成为中药痕量元素分析的一个强有力的工具[9]，另外，ICP-MS法可以同时测定多种元素的优势是原子吸收光谱法不能比拟的[10]。原子吸收光谱法分析速度慢，线性范围窄，可分析的元素也较ICP-MS和电感耦合等离子原子发射光谱少，原子荧光法则仅限于可氢化反应的几种元素如As、Se等。因此，本研究利用微波消解法作为样品预处理方法，结合ICP-MS法对冬虫夏草样本进行测定，并结合R型因子聚类分析方法对实验结果进行分析，对冬虫夏草药材的质控和用药指导具有重要意义。

1 实验部分

1.1仪器、试剂与材料

Speed wave MW-3微波消解系统(德国Berghof)；7500a型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent)；万分之一电子分析天平(德国Sartourius)；Milli-Q超纯水处理系统(18.2 MΩ，美国Milipore)。

浓硝酸(优级纯，德国Merck)、过氧化氢(优级纯，德国Merck)；液氩(纯度99.999%)；多元素混标Part#5183-4688及内标Part#5183-4680溶液(美国Agilent)，其中 Fe、K、Ca、Na、Mg、Ag、Al、As、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Mn、Mo、Ni、Pb、Sb、Se、Tl、V、Zn、Th、U的含量为1.0 mg/L；基体为体积分数10%硝酸。

稀土多元素混合标准溶液(G8500-6955，美国 Agilent) ， Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu含量均为10 mg/mL。

样品消解前均经过粉碎，本实验采用国家一级茶叶标准物质GBW 07605 (地矿部物化探研究所)进行分析方法的质量控制。冬虫夏草药材购于济南市各大药店和GAP种植基地，样品信息见表1。

表1 样品信息

1.2样品预处理

精密称定冬虫夏草样品粉末0.3 g，置于消解罐中，加入5 mL高纯硝酸，虚掩罐盖，放置过夜进行预消解，以排出硝酸与样品反应所生成的气体。然后将消解罐旋紧，放入微波炉中，按照LEAF消解程序设定的步骤进行升温消解，消解结束，待消解罐冷却后，拧开加入1 mL 过氧化氢，待样品变为无色透明溶液后，用超纯水定容至30 g，进行分析。

具体消解程序为：微波消解样品采用Speed wave MW-3微波消解系统中自带的LEAF消解程序，按照100 ℃-180 ℃-200 ℃-210 ℃的步骤进行升温，每次升温过程时间为2 min，每个温度下保持10 min，整个消解过程历时48 min。

1.3标准溶液制备

采用Agilent稀土多元素混合标准溶液Part#G8500-6955，以5%的硝酸稀释配制Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu 16种稀土元素浓度分别为0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L和10 μg/L的混合标准溶液。

以5%的硝酸作为空白，分别利用Agilent多元素混标Part#5183-4688配制Na、Mg、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Cd、Pb、Th、U等19种元素浓度分别为1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的标准溶液。对以上标准溶液进行分析，作出标准工作曲线。测定过程中以187 Re、115 In、103 Rh为内标，校正仪器可能的漂移。

1.4样品测定

将预处理的样品和标准品溶液依照表2中ICP-MS仪器工作参数进样分析。

表2 Agilent 7500a ICP-MS仪器工作参数

1.5数据处理

数据统计分析采用 DPS 数据处理系统，采用单因素方差分析(ANOVA)对所有样品的所有元素进行了差异性分析。采用R型因子聚类分析对3产地样本均值进行分析，评估不同产区冬虫夏草药材有无显著差异。

2 结果与讨论

2.1方法学考察

2.1.1 线性方程

按1.4项下条件下对不同浓度的标准溶液进样分析，得出各元素线性关系方程，结果见表3。

表3 35种元素线性方程、相关系数及检出限

2.1.2 精密度与加标回收率

按照1.4条件将同一个样品平行进样分析6次，记录结果并计算各元素含量的相对标准偏差(RSD)。实验结果表明，其RSD值均小于3.0%，即该方法精密度良好。同时，对样品进行加标回收率测定。结果表明，各元素回收率分别为Na (99.52%)、Mg (98.73%)、K (103.02%)、Ca (101.55%)、V (101.78%)、Cr (97.21%)、Mn (100.19%)、Fe (102.93%)、Co (98.38%)、Ni (97.82%)、Cu (102.69%)、Zn (103.27%)、As (99.46%)、Se (07.84%)、Mo (101.92%)、Cd (103.07%)、Pb (100.48%)、Th (98.05%)、U (96.38%)、Sc (98.26%)、Y (97.33%)、La (103.52%)、Ce (98.38%)、Pr (102.48%)、Nd (96.82%)、Sm (102.31%)、Eu (101.91%)、Gd (97.27%)、Tb (103.51%)、Dy (98.58%)、Ho (99.18%)、Er (97.37%)、Tm (103.55%)、Yb (100.63%)、Lu (102.04%)，均在96%～104%之间，符合实验要求。

2.2不同产地虫草多元素含量测定结果

对3个产区的17批冬虫夏草药材中的35种微量元素进行含量测定，分别求出不同产区的虫草药材中这35种元素含量的平均含量和17批虫草中该类元素的总平均值，结果见表4。其中，Na、Mg、K、Ca、Fe 5种元素的含量较高。Mg和 Ca作为与人类关系最为密切的常量元素，对人体的健康起着重要的作用，Mg调节胰岛素的敏感性和糖代谢的稳定性，Ca则会影响人体骨骼密度等。另外，Na 、K元素对于调节血压起着重要作用，Fe在人体内的含量远低于前4种，但其对人体造血功能具有很大的影响。在表4中可以看出，青海果洛地区的虫草所含Mg、K、Ca的量高于其他两个产区，而青海玉树产区的虫草中Na、Fe的含量较高。另外，西藏那曲产区的虫草中Ca、Fe含量远低于3个产区这两种元素含量的总平均值，这可能与当地地质环境有关。

表4 3个产地冬虫夏草药材中35种元素含量的平均值和相对标准偏差

注：*表示单位为 mg/g, 其余均为 μg/g。

Zn、Cu、Cr、Mn、Co、Se、V、Ni和Mo作为人体必需微量元素，均在各批次虫草中检出。其中，Mn、Cu、Zn含量较高，仅次于Na、Mg、K、Ca、Fe 5种元素。而且，青海果洛产区的虫草中这3种元素含量高于另外两个产区。对人体明显有害的元素如Cd、Pb、As等，也在虫草样本中均有检出。Cd在3个产区样本中的含量较为均匀，Pb、As在玉树和果洛两产区样本中的含量均远高于那曲产区。在3个产区样本中，Pb和Cd元素含量均未超过药典标准[11](Pb不得过10 mg/kg；Cd不得过1 mg/kg)，那曲产区As元素含量未超过药典标准(As不得过5 mg/kg)，但玉树产区(5.760±3.413 μg/g)、果洛产区( 7.437±2.750 μg/g)均已超过药典标准。

根据WHO规定的各元素人体每周耐受摄入量(PTWI)值(Cd: 0.007 mg/kg; Pb: 0.025 mg/kg; As: 0.015 mg/kg; Cu: 0.5 mg/kg)，结合《中国药典》中规定冬虫夏草的用量 3～9 g，最大限量计算采用其均值 6 g 为日摄入量。按照《中国药典》第四部9302项中药有害残留物限量制定指导原则推荐计算公式为：

L=AW/10M，

其中，L为最大限量理论值，mg/kg；A为每日允许摄入量，mg/kg；W为人体平均体重，kg，一般按60 kg计；M为中药材(饮片)每日人均可服用的最大剂量，kg。按照公式计算，可得出这4种有害元素限值标准分别为Cd: 1.00 mg/kg; Pb: 3.57 mg/kg; As: 2.14 mg/kg; Cu: 500 mg/kg。对比表4 可知，3个产区冬虫夏草中Cd、 Pb、 As、 Cu 4种有害元素的含量均未超标。考虑到《中国药典》一部中还没有该4种有害元素的限量标准，本研究综合考虑《中国药典》第四部9302项——中药有害残留物限量制定指导原则，以及西藏、青海不同产区多批次虫草样品含量测定结果，给出了冬虫夏草中这4种有害元素的建议质控范围为：w(Cd)<1.00 mg/kg;w(Pb)<3.57mg/kg;w(As)<2.14 mg/kg;w(Cu)<500 mg/kg。

另外，由RSD值可以看出， Na、Mg、K、Mn、Zn、Cu、As、Cd这8种元素在3个产区虫草中的含量差别较小，分布较为均匀。元素Tm的含量差异性最大，其RSD值高达0.806。综合来看，稀土元素的差异性大于其余元素的差异性。

2.3 R型因子聚类分析

R型因子聚类分析是一种快捷、简便的聚类分析方法，目前已被用于中药质量评价[12]。为了简洁、明确地判别虫草药材中微量元素和其中的稀土元素含量的产地差异，我们将3个产区的虫草样品中这些元素含量的数据进行了R型因子聚类分析，结果见图1。由图1可以看出，那曲产区的均值Nave与另外两组玉树和果洛的均值Yave和Gave的聚类较远，说明那曲产区的虫草样本与另外两个产区果洛和玉树的虫草样本差异性较大。果洛与玉树同属于青海省且相邻，因此两地样本聚类较近，差异性较小。

Yave：玉树产区均值；Gave：果洛产区均值；Nave：那曲产区均值。图1 3个产地各元素含量均值R型因子聚类分析Fig.1 R-type cluster analysis of element contents in 3 areas

3 结论

本文利用微波消解-ICP-MS法对西藏、青海产区的17批冬虫夏草样本中35种微量元素(含16种稀土元素)的含量进行测定，并用R型因子聚类分析对样本进行分析。该方法操作简便、灵敏度高、能耗较小、污染少、效率较高，适用于大量样本元素分析和产地鉴别。该研究为冬虫夏草药材的质控和用药指导提供了科学依据。然而，就目前的研究状态看，ICP-MS法运行成本高是其主要的缺陷。未来可以针对其运行成本问题加以优化，来实现低成本运行。

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Determination of35elements in Chinese caterpillar fungus from Qinghai and Tibet by microwave digestion-ICP-MS

ZHANG Min-min1,ZHAO Heng-qiang1,ZHAO Zhi-guo1,LIU Wei1, LIU Qian1,LIANG Yan1,GENG Yan-ling1,HUANG Lu-qi2,WANG Xiao1*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory Breeding Base of TCM Quality Control Technology, Process Control Research Center of Traditional Chinese Medicine of Shandong Academy of Sciences, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China; 2.National Resource Chinese Center for Materia Medica, Key Laboratory of Road to the Cultivation of Chinese Medicine ，China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700,China)

R284.1

A

1002-4026(2017)05-0014-07

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.05.003

2017-05-10

中央本级重大增减支项目(2060302)；国家自然科学基金重点项目(81130070)

张敏敏(1990—)，女，硕士研究生， 研究方向为中药分析与质量控制。E-mail:zhangminminff@163.com

*通信作者，王晓(1971—)，男，研究员，博士，研究方向为中药质量控制研究。Tel: 0531-82605319,E-mail: wxjn1998@126.com