鲢鱼头磷脂对菜籽油抗氧化作用分析

王梓博，万 欣，王文倩，王 琦,2，王学东，张维农,2，陈季旺

(1．武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023； 2．武汉轻工大学 油脂及植物蛋白工程技术研发中心，湖北 武汉 430023)

鲢鱼头磷脂对菜籽油抗氧化作用分析

王梓博1，万 欣1，王文倩1，王 琦1,2，王学东1，张维农1,2，陈季旺1

(1．武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023； 2．武汉轻工大学 油脂及植物蛋白工程技术研发中心，湖北 武汉 430023)

应用Schaal烘箱法检测鲢鱼头磷脂对菜籽油的抗氧化作用，结果表明：随着鲢鱼头磷脂添加量增加，对菜籽油抗氧化作用增强，且不同浓度的鲢鱼头磷脂效果都好于添加0.02%特丁基对苯二酚(TBHQ)组，但鲢鱼头磷脂添加到0.1%后再增加对抗氧化作用改善效果有限；添加0.1%鲢鱼头磷脂对菜籽油的抗氧化效果优于0.1%大豆卵磷脂。磷脂组成与脂肪酸分析结果显示磷脂组成和脂肪酸组成的特点是鲢鱼头磷脂对菜籽油具有优良抗氧化作用的主要原因。

鲢鱼头磷脂；菜籽油；Schaal烘箱法；过氧化值

Abstract：Antioxidant effect of silver carp head phospholipids on rapeseed oil were studied by using Schaal oven method, and the results showed that the antioxidant effect on rapeseed oil increased as more silver carp phospholipids added, and with all the tested concentrations, silver carp phospholipids showed better effect than 0.02% Tert-Butylhydroquinone (TBHQ), but when the concentration was more than 0.1%, the increasing of antioxidant capacity was not obvious, and the antioxidant effect on rapeseed oil of adding 0.1% silver carp head phospholipids was superior to 0.1% soybean lecithin. Analysis of phospholipids and fatty acid composition showed that the characteristic compositions of phospholipids and fatty acids were the main reason for silver carp head phospholipids owning excellent antioxidant effect on rapeseed oil.

Key words：silver carp head phospholipids; rapeseed oil; Schaal oven method; Peroxide value

1 引言

菜籽油是我国主要食用油之一，生产于长江流域及西南、西北等地，产量居世界首位[1]。菜籽毛油中除主要含甘油三酯外，还含有甾醇、生育酚、磷脂、色素、游离脂肪酸等微量物质，不仅影响菜籽油的品质，而且给加工带来困难，通常通过精炼去除[2]。油脂在储藏和加工过程中，受到温度、光照、氧气含量、水分等因素的影响会发生氧化[3]，研究表明适量的甾醇/生育酚、磷脂对油脂有抗氧化作用[4,5]。现有的油脂精炼工艺往往过度加工，造成微量成分过度脱除，对菜籽油的氧化稳定性有不利影响，需另外采取工艺技术进行保护[6]。

添加抗氧化剂到食用油中是保证油脂品质、延缓油脂氧化的一种有效方法。目前在国内市场上食用油产品中常用的抗氧化剂是叔丁基对苯二酚(TBHQ)，属于合成抗氧化剂，对煎炸油有很好的抗氧化效果，但有研究表明其可能会导致有机体发生突变，试验发现包括TBHQ在内的许多合成抗氧剂对人体内脏器官有一定的副作用，在部分国家已经停止在食品中使用，探索在食用油脂中使用安全的天然抗氧化剂日益受到人们的重视[4]。

研究表明，在适当的条件下，天然磷脂对油脂具有较好的抗氧化作用，主要跟磷脂的组成结构和油脂种类有关，但机理还没有完全明确[7]。Judde[8]等发现大豆卵磷脂对菜籽油有一定抗氧化效果，陈文娟[9]等发现海水鱼大黄鱼的鱼卵磷脂对菜籽油具有抗氧化作用，而淡水鱼来源磷脂对菜籽油的抗氧化作用研究还鲜有报道。鲢鱼作为我国主要养殖淡水鱼种，产量居我国淡水鱼品种前列，价格低廉，肉质较好，目前已成为很好的水产加工原料，但加工过程中产生的鲢鱼头通常得不到有效利用。本实验室前期研究表明鲢鱼头中具有一定量含n-3型多不饱和脂肪酸的磷脂[10]。本文从鲢鱼头中制备磷脂，检测其在菜籽油中的抗氧化性质，为鲢鱼头的合理加工利用提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料

某品牌菜籽油(四级，不添加TBHQ及其他抗氧化剂)购自武汉市常青花园武商量贩店，大豆卵磷脂(L-α-Lecithin，P5638)和脂肪酸甲酯标准品(混标)购自Sigma公司，氯仿、甲醇、丙酮、乙醇、乙醚、氢氧化钠、盐酸、磷酸、硫代硫酸钠、冰乙酸、异辛烷、可溶性淀粉、碘化钾等试剂均为分析纯。

2.2 主要仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；硅胶薄板：青岛海洋化工厂分厂；超声波清洗机：济宁天华超生电子仪器有限公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；可见光分光光度计：上海天呈医流科技有限公司；气相色谱仪：上海安捷伦有限公司。

2.3 方法

2.3.1 鲢鱼头磷脂提取

参考邹舟等[10]方法，采用改进的Bligh-Dyer法对鲢鱼头进行总脂质提取，鲢鱼头切碎后取100 g，加入100 mL氯仿和200 mL甲醇，匀浆搅拌20 min，抽滤再加100 mL氯仿洗残渣，合并滤液，向滤液中加100 mL 0.88% KCl溶液，混匀后倒入分液漏斗，静置分层3 h，取下层氯仿层，于55 ℃真空旋转蒸发去除氯仿得鲢鱼总脂质。称取0.2 g鲢鱼头总脂质上硅胶层析柱，依次用200 mL氯仿、100 mL丙酮、200 mL甲醇洗脱，将甲醇洗脱液收集，于55 ℃真空旋转蒸发去除甲醇即得鲢鱼头磷脂。

2.3.2 不同浓度鲢鱼头磷脂抗菜籽油氧化能力的测定

称取50 g精制菜籽油置于100 mL小烧杯中，按菜籽油质量的0.05%、0.1%、0.2%、0.5%分别添加鲢鱼头磷脂，轻轻搅拌后先高速均质器均质以20000 r/min处理3 min，然后用超声水浴锅超声处理10 min，使磷脂完全在油中溶解，无肉眼可见不溶物。采用Schaal烘箱法，将添加鲢鱼头磷脂后的菜籽油样品放入60±0.5℃恒温烘箱中做加速氧化试验，保持烧杯敞口，每隔24h搅拌一次，定期测定油样的过氧化值(POV)，方法参照GB 5009.227-2016[11]，同时做空白对照组(精制菜籽油样，不添加抗氧化剂成分)，以及精制菜籽油样品中添加0.02%特丁基对苯二酚(TBHQ)对照组(添加量参考GB2760-2014[12]，TBHQ在植物油中的最大添加量不超过油脂质量的0.02%)。

2.3.3 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂对菜籽油抗氧化能力对比

按1.3.4方法将鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂按0.1%的添加量分别加入50g菜籽油样品，同时做空白对照，加速氧化方法和POV测定方法同上。

2.3.4 磷脂薄层层析(TLC)分析

将鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂加入氯仿溶解，分别配制200 mg/mL的溶液进行薄层色谱分离，展开剂为氯仿:甲醇:水=65:25:4(V/V)，显色剂为8%醋酸铜-磷酸。

2.3.5 磷脂脂肪酸组成分析

甲酯化方法：取20 mg鲢鱼头磷脂或大豆卵磷脂样品加入2 mL 0.5 mol/L氢氧化钠甲醇溶液，置于65 ℃水浴保温3 min，然后加入2 mL三氟化硼-甲醇溶液，再在65 ℃水浴保温3 min，取出冷却。加2 mL正己烷混合均匀，取上清液，以3000 r/min的转速离心10 min。最后取上清液过0.2 μm的有机滤膜后收集，进行气相色谱进样分析。

色谱条件：7820A型Agilent气相色谱仪，色谱柱使用sp-2560石英毛细柱(100 m×250 μm×0.2 μm)；升温程序为先100 ℃保持4 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持20分钟；载气(N2)流速3 mL/min，压力35.089 kPa，进样量2 μL，不分流；检测器为离子火焰检测器(FID)。使用脂肪酸甲酯标准品确定脂肪酸种类，通过出峰面积比表征脂肪酸含量。

3 结果与分析

3.1 鲢鱼头磷脂提取

以鲢鱼头湿重为基准计算鲢鱼头磷脂提取率为1.18±0.05%(m/m)。

3.2 不同浓度鲢鱼头磷脂对菜籽油的抗氧化作用分析

不同添加量的鲢鱼头磷脂对菜籽油的抗氧化作用如图1所示。

图1 不同浓度鲢鱼头磷脂对菜籽油的抗氧化能力

在60 ℃烘箱中随加速氧化时间的延长，各油脂样品的过氧化值均呈增大趋势。本试验菜籽油样品为四级菜籽油，按照GB/T 1536-2004[13]，合格的四级成品菜籽油的POV值不超过6.0 mmol/kg，试验菜籽油样品的起始POV值为3.4 mmol/kg左右，符合标准。随着加速氧化时间延长，空白对照和添加0.02%TBHQ的菜籽油样品分别在6 d和9 d超过6.0 mmol/kg，而添加0.05%和0.1%鲢鱼头磷脂后延长至12 d，添加0.2%和0.5%鲢鱼头磷脂后则延长至15 d。与空白样品对比，0.02%TBHQ组在0-9 d可以较为有效地减缓菜籽油POV值增加趋势，但之后POV值和空白对照基本相同，其抗氧化作用失效，而不同浓度鲢鱼头磷脂均能在0-21 d有效地减缓菜籽油POV增长趋势，效果均好于0.02%TBHQ，尤其是从9 d开始之后的效果差异显著。随着磷脂添加量的增加，其抑制POV值作用增强，但添加量达到0.1%之后再增加得到的增强效果有限(尤其是15 d之后)。在试验过程中还观察到，添加0.05%和0.1%鲢鱼头磷脂的菜籽油样品直到试验结束仍能保持澄清透明，而添加0.2%和0.5%鲢鱼头磷脂的菜籽油样品随贮藏时间延长，在后期出现较明显的半透明絮状物。推测是因为菜籽油中添加磷脂的量超过一定浓度后，在长时间静置和受热条件下不能保持稳定，磷脂会逐渐以絮状胶体形态析出。

3.4 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂对菜籽油抗氧化作用对比分析

比较了添加0.1%鲢鱼头磷脂和0.1%大豆卵磷脂的抗菜籽油氧化能力，结果如图2所示。随着氧化加速试验时间的延长，各菜籽油样品的过氧化值都不断增加，与空白对照组相比，两种磷脂都可以有效延缓POV的增加趋势，鲢鱼头磷脂组的效果更为明显，POV直至13 d试验结束时超过6 mmol/kg，而空白对照组和大豆卵磷脂组则分别在7 d和9 d超过6 mmol/kg。

图2 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂对菜籽油的抗氧化能力比较

3.2 磷脂薄层色谱(TLC)分析

醋酸铜磷酸试剂使磷脂显色为黑色斑点，结果如图3所示，参照邹舟等[10]确定鲢鱼头磷脂中主要成分为磷脂酰乙醇胺(phosphatidythanmine，PE)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine，PS)；而大豆卵磷脂除同样含有PE、PC和PS外，还含有磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)及另一未知磷脂组分。

使用Scion image 软件对TLC分析谱图进行扫描定量分析处理，结果见表1。结果显示两种磷脂都是以PC含量最高，占40%以上，其次是PS，占20～30%，再次是PE，含量在10～20%。鲢鱼头磷脂的PC、PS含量明显高于大豆卵磷脂，两者PE含量接近，前者含量稍高。大豆卵磷脂比鲢鱼头磷脂多了两种磷脂，分别是含量在14%左右的PI和8%的未知组分。根据未知组分在薄层上的位置得到其是一种头部极性比较弱的磷脂，结合Judde[8]等大豆卵磷脂的组成分析结果，推测未知组分很可能是磷脂酸( phosphatidic acid，PA)。

图3 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂的薄层色谱图

表1 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂组分含量

组别鲢鱼头磷脂大豆卵磷脂未知组分/∗8．0%±0．8%磷脂酰乙醇胺(PE)15．3%±1%a11．1%±1．1%a磷脂酰胆碱(PC)56．8%±3．5%a45．3%±4．2%b磷脂酰丝氨酸(PS)27．9%±1．5%a20．7%±1．7%b磷脂酰肌醇(PI)/13．9%±1．1%

*表示未检出，下同

同一行数据标有不同小写字母表示差异性显著(p<0.05)

3.3 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂气相色谱分析

鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂脂肪酸组成，见表2。从结果中可以看到鲢鱼头磷脂中检测出11种脂肪酸，其中饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)4种，单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)2种，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)5种，脂肪酸中含量最高的为C16:0(棕榈酸)，占总脂肪酸的45%以上，其次为C18:1(油酸)，占近20%；大豆卵磷脂中检测出7种脂肪酸，其中SFA2种，MUFA2种，PUFA3种，含量最丰富的脂肪酸为C18:2n-7(亚油酸)，占55%以上，其次为棕榈酸，占25%以上。鲢鱼头磷脂的脂肪酸组成以SFA为主(60%以上)，含量是大豆卵磷脂的2倍，两者的SFA都主要是棕榈酸。鲢鱼头磷脂的MUFA 含量达25%以上，为大豆卵磷脂的4倍，两者的MUFA主要都是油酸，其余为C16:1n-7(棕榈油酸)，而前者棕榈油酸占总脂肪酸6%左右，后者则仅为0.1%。鲢鱼头磷脂的PUFA含量只有14%左右，远低于大豆磷脂的65%，但前者的PUFA种类较丰富，除亚油酸外还含C18:3n-3(亚麻酸)、C20:4n-6(花生四烯酸)、C20:5n-3(Eicosapentaenoic acid，EPA)和C22:6n-3(Docosahexaenoic acid，DHA)，而大豆卵磷脂的PUFA大部分是亚油酸，其余为亚麻酸。

表2 鲢鱼头磷脂和大豆卵磷脂主要脂肪酸组成

脂肪酸含量(%)鲢鱼头磷脂大豆卵磷脂C14：03．08±0．12/∗C16：046．89±0．80a24．80±0．47bC16：1n⁃76．51±0．02a0．11±0．00bC17：01．71±0．62a0．13±0．01bC18：09．28±0．39a3．24±0．04bC18：1n⁃918．50±0．53a6．66±0．06bC18：2n⁃61．35±0．05b57．99±0．36aC18：3n⁃31．65±0．03b7．06±0．10aC20：4n⁃64．53±0．19/C20：5n⁃33．80±0．03/C22：6n⁃32．69±0．02/∑SFA60．96±0．33a28．17±0．53b∑MUFA25．02±0．56a6．77±0．07b∑PUFA13．80±0．22b64．59±0．46a

*表示未检出，下同

同一行数据标有不同小写字母表示差异性显著(p<0.05)；SFA表示饱和脂肪酸；MUFA表示单不饱和脂肪酸；PUFA表示多不饱和脂肪酸

4 讨论

陈文娟[9]等利用Schaal烘箱法探究大黄鱼鱼卵磷脂对不同油脂的抗氧化作用，结果显示随着强行氧化时间的延长，油脂的过氧化呈增大趋势，与空白样品对比，磷脂对菜籽油有较好的抗氧化作用，并且随着磷脂添加量的增大，其抗氧化作用越明显，本试验结果与其一致。但鲢鱼头磷脂在菜籽油中的添加量为0.2%和0.5%时，在加速试验后期有絮状物析出，且添加量为0.1%时同0.2%、0.5%的抗氧化效果接近，故在实际应用时添加量可控制在0.1%附近，既能保证良好抗氧化效果前提下的经济合理添加量，又能避免过高添加量导致絮状物析出影响感官效果。

Judde[8]等人将不同种类大豆卵磷脂添加到菜籽油中，试验结果显示含有较高比例PC和PE的大豆卵磷脂抗氧化效果最佳。有研究表明，磷脂的抗氧化活性和侧链极性头部基团有关，Saito和Ishihara[14]发现，PC和PE的极性头部侧链分别为胆碱和乙醇胺，具有活性氨基，因此对氢过氧化物有清除作用，而PA的侧链基团没有活性氨基，则无作用。Dacaranhe和Terao[15]发现PS对PC的过氧化物具有清除作用，而PA无作用，指出PS的极性头部起到关键作用，同时也提出链接的脂肪酸侧链也扮演重要角色，最终PS的抗氧化活性与整体空间结构有关。Nwosu[16]等发现PC比PE能更好地抑制三文鱼油氧化，PC结合的脂肪酸中SFA越多抗氧化能力越强，而且脂肪酸链长度越长(>C18)能力越强。Grandois[17]等发现油酸和亚油酸与PC结合后，在高温下的氧化稳定要优于其结合在甘油三酯上，指出PC的胆碱基团促进了脂酰基的稳定性。Cortie[18]等指出结合更多SFA和MUFA的磷脂氧化稳定性更好，可以促进结合PUFA磷脂的氧化稳定性，具有对细胞膜的抗氧化作用。

本试验中的鲢鱼头磷脂只由PC(55%左右)、PS(25-30%)、PE(15%左右)三种具有较好抗氧化活性的磷脂组成，含量都分别高于大豆卵磷脂中组成，而且大豆卵磷脂中除这三种磷脂外还含有PI、PA(推测)等无显著抗氧化活性的磷脂成分；鲢鱼头磷脂结合的脂肪酸中SFA占了大部分(>60%)，MUFA含量也达25%左右，PUFA含量较低但含有较多花生四烯酸、EPA、DHA等长碳链(>C18)的PUFA，都有利于其抗氧化能力，而大豆卵磷脂脂肪酸主要由含18个碳的亚油酸PUFA组成(>55%)，所有脂肪酸的长度都没有超过18个碳原子。鲢鱼头磷脂的磷脂组成和脂肪酸组成特点决定了其抗氧化性强于大豆卵磷脂，这就解释了其在菜籽油中的抗氧化作用明显强于后者的原因。大豆卵磷脂PC(45%左右)、PS(20%左右)为主，含有一定量的PE(10%左右)，且结合的脂肪酸有一定量的SFA(>25%)，也具有一定的抗氧化特征，所以对菜籽油也具有一定的抗氧化活性。Nwosu[16]的试验还发现磷脂对油脂的抗氧化活性跟油脂的脂肪酸组成有关，同一种磷脂在不同种类的油脂中的抗氧化效果会出现较大差异。鲢鱼头磷脂在菜籽油之外的油脂中、不同品种来源的菜籽油(脂肪酸组成不同)中的抗氧化能力是否会出现差异，还需更多的试验数据验证。

我国鲢鱼产量高，鱼头等加工副产物急需高值化综合利用，而以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂正逐渐成为食品、医疗保健行业发展的一种趋势。作为一种天然磷脂，鲢鱼头磷脂可以从水产加工副产物鲢鱼头中大量获得，与TBHQ和大豆卵磷脂相比，在菜籽油中具有更加优良的抗氧化性质，具有重要的开发和应用价值。

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Analysis of antioxidant effect of silver carp head phospholipids on rapeseed oil

WANGZi-bo1，WANXin1，WANGWen-qian1，WANGQi1,2，WANGXue-dong1，ZHANGWei-nong1,2，CHENJi-wang1

(1.School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Research Center of Oils and Plant Proteins Technology, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

1017-05-10.

王梓博(1995-)，男，本科，E-mail：w270102383@126.com.

王琦(1981-)，男，副教授，博士，E-mail：wq311zb@hotmail.com.

武汉轻工大学大学生创新训练计划项目(CXXL20161015).

2095-7386(2017)03-0027-06

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.03.005

TS 254.9

A