光枝勾儿茶主要成分提取工艺的优化

唐远江，尚以顺，周思旋，杨粤黔，张 涛，余 波

（1.贵州宏宇畜牧技术发展有限公司，贵州 贵阳 550005；2. 贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005）

光枝勾儿茶主要成分提取工艺的优化

唐远江1，2，尚以顺1，周思旋2，杨粤黔1，2，张 涛1，2，余 波1，2

（1.贵州宏宇畜牧技术发展有限公司，贵州 贵阳 550005；2. 贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005）

光枝勾儿茶是民族中药材，为研究同时提取光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素的最佳条件，采用回流提取法、响应面分析法，考察乙醇体积分数、提取温度、料液比3个因素及其交互作用和提取时间对提取工艺的影响。结果表明，光枝勾儿茶芦丁和槲皮素的最佳提取条件为乙醇体积分数73.72%、温度60.52℃、液料比32.21 mL/g，提取时间3 h，芦丁、槲皮素的提取率分别为18.55、0.36 mg/g，通过试验验证得到芦丁、槲皮素的提取量平均值分别为18.48、0.35 mg/g，与理论值相比误差小。试验结果为光枝勾儿茶芦丁和槲皮素的开发和利用提供理论依据。

光枝勾儿茶；芦丁；槲皮素；回流提取；响应面

Abstract：Berchemia polyphylla var. leioclada. is a national medicine plant. In order to find the optimum condition of rutin and quercetin from B. polyphylla var. leioclada. reflux extraction method and surface response analysis were used，ethanol concentration，extraction temperature，solid-liquid ratio factors and their ineraction and extracting time were designed to optimize the extracting process. The results showed that the best extraction condition of rutin and quercetin were selected with 73.72% alcohol，60.52℃ and 32.21 mL/g of solid-liquid ratio，extracting time was 3 h. The extraction rates of rutin and quercetin were 18.55 and 0.36 mg/g，respectively.Through experiment study，the average of rutin and quercetin were 18.48 and 0.35 mg/g，respectively，which had a lillte error to the theory value. The results provide a theoretical basis for further development and use of rutin and quercetin from B. polyphylla var. leioclada.

Key words：Berchemia polyphylla var. leioclada.；rutin；quercetin；reflux extraction；response surface

光枝勾儿茶（Berchemia polyphylla var.leioclada.）属于鼠李科勾儿茶属植物，是铁包金的一种，又名老鼠耳、乌龙根，贵州苗家常用药材，多以根、茎、叶入药，有清热利湿，化痰止咳等功效［1］。勾儿茶属植物味苦、平，具有止血止痛、祛风湿等功效，对风湿性关节炎、肺结核、荨麻疹、急慢性气管炎、黄疸、睾丸肿痛、妇女痛经、痢疾、跌打损伤、痈肿疮毒等症有良好治疗作用［2］。研究表明，该属植物的化学成分包括苷类、醌类、木脂素类、萜类以及黄酮类［3］等，具有抗氧化［4］、抗肿瘤［5-6］、抗腹泻［7］、消炎镇痛［8］、抑菌［9］等作用。勾儿茶属植物作为一种重要的中药材，在临床、中兽药研发上具有重要作用，以勾儿茶属植物为主要入药的止痢散能有效抗腹泻［10］，且对动物无毒副作用［11］。

由于中兽药制剂多为复方制剂，很难对其中单一成分的药效进行评估，因此必须根据有效成分含量对复方制剂进行质量控制。广西中药材标准规定以芦丁、槲皮素、β-谷甾醇为铁包金药材的指标成分，根据有效成分含量多少进行质量优劣评估［12］。芦丁、槲皮素属于黄酮类化合物，黄酮类化合物的提取方法有煎煮法、回流提取法、索氏提取法、超声提取法等［13］。工业化生产中多采用煎煮法和回流提取法，但水煎煮法很难有效提取黄酮类化合物［14］。光枝勾儿茶作为一种重要的兽用中药材，目前关于其芦丁和槲皮素的提取研究较少。本研究为了确定同时提取光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素的最佳工艺，通过回流法提取目标物质，采用响应面法优化提取条件，以期能有效开发和利用光枝勾儿茶中的芦丁和槲皮素，同时为以该植物入药的中兽药提供质量控制依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

光枝勾儿茶样品，由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室提供，经贵州省畜牧兽医研究所尚以顺研究员鉴定为Berchemia polyphylla var. leioclada.。芦丁、槲皮素对照品购自上海源叶生物科技有限公司，色谱甲醇购自赛默飞世尔科技有限公司，试剂均为分析纯。试验主要设备包括BSA224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、LC-20高效液相色谱仪（日本岛津公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线绘制 分别精密量取0.4 mg芦丁、槲皮素对照品，置入10 mL容量瓶，加入少量甲醇，超声溶解，冷却后定容，配制成0.4 mg/mL的芦丁、槲皮素标准溶液，分别以两种对照品溶液为标样，精密量取配制成含有芦丁、槲皮素 0.016、0.032、0.048、0.064、0.080 mg/mL的混合液。HPLC检测芦丁、槲皮素含量，分别以峰面积的积分值Y为纵坐标，芦丁、槲皮素浓度X为横坐标，绘制标准曲线。根据线性范围，连续进样6次，计算回样品收率和峰面积相对标准偏差（RSD）检测条件［15］：色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水=55∶45，柱温28℃，检测波长为257 nm，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min。

1.2.2 乙醇体积分数对提取率的影响 取光枝勾儿茶粉末1 g，按照液料比30 mL/g分别加入体积分数为0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液，70℃下回流提取2 h，以4 000 r/min离心10 min，沉淀部分重复提取1次，合并浓缩上清液，置于50 mL容量瓶中，定容、摇匀后过0.45 μm滤膜得到供试品溶液。HPLC检测芦丁、槲皮素含量。每个试验组3次平行（下同）。

1.2.3 料液比对提取率的影响 称取光枝勾儿茶粉末 1 g，按照液料比为 10、20、 30、40、50 mL/g分别加入70%乙醇溶液，70℃下回流提取2 h后检测芦丁、槲皮素的含量。

1.2.4 提取时间对提取率的影响 称取光枝勾儿茶粉末1 g，按照液料比为30 mL/g加入70%乙醇溶液，70℃下分别提取 1、2、3、4、5 h，检测芦丁和槲皮素的含量。

1.2.5 提取温度对提取率的影响 称取光枝勾儿茶粉末1 g，按照料液料比为30 mL/g加入70%乙醇溶液，分别在 50、60、70、80、90℃温度条件下回流提取2 h，检测芦丁和槲皮素的含量。

1.2.6 Box-Behnken试验 根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以芦丁、槲皮素含量为目标函数响应值，选取乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、温度（X3）设计3因素3水平的响应面分析试验，其因素水平见表1。

表1 响应面试验设计

2 结果与分析

2.1 标准曲线

试验得到芦丁、槲皮素的标准曲线为别为Y= （2E+07） X-11925，R2= 0.9965，Y = （2E+07）X-36384，R2= 0.9962，芦丁平均回收率为97.91%，RSD为2.85%，槲皮素平均回收率为98.64%，RSD为3.14%，表明芦丁和槲皮素浓度均在0.016～0.080 mg/mL内与峰面积线性关系良好。

2.2 最佳乙醇体积分数

乙醇体积分数为0、20%、40%、60%、80%、100%时，光枝勾儿茶芦丁含量分别为1.89、3.02、6.11、13.68、18.32、18.55 mg/g，槲皮素含量分别为 0.08、0.12、0.25、0.32、0.34、0.35 mg/g。乙醇浓度越高，主要成分的提取量越高，但工业生产成本也高，因此初步确定最佳乙醇体积分数为60%。

2.3 最佳料液比

料液比为 10、20、30、40、50 mL/g时，光枝勾儿茶芦丁含量分别为10.25、15.64，17.38、17.68、16.32、15.69 mg/g，槲皮素含量分别为0.12、0.26、0.35、0.32、0.27、0.24 mg/g，液料比为35 mL/g 时芦丁、槲皮素的提取量均达到最大。提取溶剂极性与目标成分极性越相近越有利于目标成分提取［16］，但增大溶剂量也增加浓缩时间，造成浓缩时能量损耗，因此选择液料比30 mL/g 较合适。

2.4 最佳提取时间

提取时间为1、2、3、4、5 h时，光枝勾儿茶芦丁含量分别为16.85、17.74、18.68、18.03、17.92 mg/g，槲皮素含量分别为0.24、0.32、0.38、0.42、0.39 mg/g。两者提取量在提取时间为3 h时达到最高，长时间加热可使芦丁、槲皮素发生降解而转变成其他物质，由此确定最佳提取时间为3 h。

2.5 最佳提取温度

提取温度为 50、60、70、80、90℃时，光枝勾儿茶芦丁含量分别为14.84、17.83、18.78、17.24、15.71、15.16 mg/g；槲皮素含量分别为0.35、0.42、0.38、0.33、0.29、0.26 mg/g。芦丁的提取量在60℃时达到最大，槲皮素的提取量70℃时达到最大，但与60℃时相差不大。高温条件有利于芦丁、槲皮素浸出，但高温条件下两者易发生降解、缩合、氧化等化学反应而影响其稳定性［17］。因此初步选择60℃作为最佳提取温度。

表2 响应面试验结果

2.6 响应面分析提取工艺

2.6.1 响应面模型回归分析 响应面试验结果见表2，采用Design-Expert 8.0.6 Trial软件对表2进行多元回归拟合，建立芦丁、槲皮素提取量对X1、X2、X3的二次多项回归方程，芦丁提取量Y = 18.43+1.12X1-0.24X2+0.46X3-

槲皮素提取量Y = 0.38+（2.500E-003）X1-（1.250E-003）X2+0.019X3+（7.500E-003）

2.6.2 芦丁提取条件的响应面分析 由表3可知，模型F值为35.73，P＜0.001，说明响应回归模型极显著。失拟项P=0.0712＞0.05，失拟不显著，模型校正系数R2=0.9232，说明该模型拟合度较好，可用该模型对芦丁提取进行分析和预测。由P值可知各因素中二次项、、影响均显著，对芦丁提取量的影响大小：X1＞X3＞X2。各个因素交互实验的响应面如图1所示。响应面图呈马鞍形表示两个因素交互作用显著，圆形则表示不显著［18］。由图1可知X1和X3，X2和X3的响应面陡峭，表明他们之间交互作用较显著，X1和X2相互作用不显著。

表3 芦丁提取条件的方差分析

图1 乙醇体积分数、温度和液料比交互作用对芦丁提取影响的响应

2.6.3 槲皮素提取条件的响应面分析 由表4可知，模型F值为9.18，P＜0.001，说明响应回归模型极显著。失拟项P=0.4063＞0.05，失拟不显著，模型校正系数R2=0.9259，说明该模型拟合度良好。由P值可知各个因素中二次项小：X3＞X1＞X2。各个因素交互实验的响应面见图2。图2所示X1和X3，X2和X3的响应面图陡峭，表明其交互作用显著，X1和X2相互作用不显著。

2.6.4 最优提取条件 根据回归模型分析得到光枝勾儿茶中芦丁、槲皮素的最优提取条件为乙醇体积分数73.72%、提取温度60.52℃、液料比32.21 mL/g，提取时间3 h，芦丁、槲皮素含量的理论值分别为18.55、0.36 mg/g。在此最佳工艺条件下，通过3次平行试验验证后得到芦丁、槲皮素的提取量平均值分别18.48、0.35 mg/g，在误差范围内达到试验预期目的，说明此工艺提取光枝勾儿茶主要成分工艺可靠。

表4 槲皮素提取条件的方差分析

图2 乙醇体积分数、温度和液料比交互作用对槲皮素提取影响的响应

3 结论与讨论

本试验得到光枝勾儿茶芦丁、槲皮素的最优提取条件为乙醇体积分数73.72%、提取温度60.52℃、液料比32.21 mL/g、提取时间3 h。根据文献报道，芦丁和槲皮素的最佳提取条件有所不同。刘晓静等［19］采用浸渍法取红枣中芦丁的最佳条件是乙醇体积分数74%、温度72℃、液料比43 mL/g，与之相比，本试验的液料比较低，乙醇体积分数相差不大、提取温度较高。柯发敏［20］的研究得出回流法提取赶黄草中槲皮素的最佳条件为乙醇体积分数80%、温度75℃、液料比15 mL/g，与之相比，本试验的液料比较高，提取温度、乙醇体积分数较低。

本试验在考察提取时间对芦丁和槲皮素提取率的影响时发现，提取时间越长，温度始终保持恒定，但主要成分的提取率有所下降，因此在响应面设计中不考虑提取时间的影响。同时在提取过程发现提取3次可使有效成分完全浸出，故每个平行试验均提取3次。响应面法是国内外常用的试验分析方法，采用非线性模型拟合，准确性高，实验精度优于正交设计，试验预测值能更好地考察参数合理性和试验设计的准确性［21］。本试验首次采用响应面法优化光枝勾儿茶芦丁和槲皮素的提取条件，响应面分析表明，高浓度的乙醇有利于芦丁的提取，但在工业化生产中使用高浓度乙醇成本较高，因此在后续试验中应降低乙醇体积分数来考察芦丁和槲皮素的最优提取条件。

光枝勾儿茶的复方制剂在临床上已有许多运用，本试验的提取工艺为光枝勾儿茶芦丁和槲皮素的开发利用提供了理论支持，但粗提物成分复杂，难以确定各成分的生物活性，在后续的研究中，项目组应对该药材的化学成分和药理作用进行研究，明确各化学成分的活性，使该药材在开发利用和临床研究上具有重要意义。

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（责任编辑 崔建勋）

Extraction optimization of main ingredients from Berchemia polyphylla var. leioclada.

TANG Yuan-jiang1，2，SHANG Yi-shun1，ZHOU Si-xuan1，YANG Yue-qian1，2，ZHANG Tao1，YU Bo1，2
（1.Guizhou Hongyu Animal Husbandry Technology Development Ltd，Guiyang 550005，China；2. Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang 550005，China）

R284.2

A

1004-874X（2017）06-0114-06

唐远江，尚以顺，周思旋，等.光枝勾儿茶主要成分提取工艺的优化［J］.广东农业科学，2017，44（6）：114-119.

2017-04-21

贵州省科学技术重大专项（黔科合[2013]6014）；贵州省农业科技计划建设项目（黔科合农G字[2015]4001）

唐远江（1987- ），男，硕士，研究实习员，E-mail：tangyjjay0909@126.com

余波(1981- )，男，硕士，副研究员，E-mail：yubonky@163.com