牛膝多糖对体外培养猪肠上皮细胞增殖的影响

王 雄，李孟伟，陈清华

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

牛膝多糖对体外培养猪肠上皮细胞增殖的影响

王 雄1，李孟伟2，陈清华1

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

试验旨在研究不同浓度牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS）对体外培养的仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）正常或脂多糖（LPS）诱导的免疫应激模型中细胞增殖的影响。结果表明，正常培养条件下，额外添加1 200 μg/mL浓度的ABPS组在24 h时间点细胞增殖效果显著高于对照组及其他试验组（P＜0.05）；在48 h和72 h时间点，添加ABPS的所有组细胞增殖效果显著高于对照组（P＜0.05）。此外试验通过脂多糖（LPS）诱导建立IPEC-J2免疫应激模型，结果表明，额外添加ABPS的所有组在24 h和72 h时间点，细胞增殖效果显著高于对照组（P＜0.05）；在48 h时间点，900和1 200 μg/mL ABPS组细胞增殖效果显著高于对照组（P＜0.05）。综上所述，ABPS能显著促进正常培养条件下IPEC-J2增殖，也能显著缓解LPS对IPEC-J2增殖的抑制，试验中以添加浓度为1 200 μg/mL的ABPS效果最好。

牛膝多糖；IPEC-J2；LPS；增殖

AbstractThe aim of the present study was to investigate the effect of different concentrations of ABPS on proliferation of piglets jejunum epithelial cells,normal or the immunological stress of lipopolysaccharide in vitro.The results showed that the proliferation of ABPS group at the concentration of 1 200 μg/mL was significantly higher than that of the control and other groups(P＜0.05).At 48 h and 72 h,ABPS was added at all time points(P＜0.05).In addition,the IPEC-J2 immunosuppressive model was induced by lipopolysaccharide (LPS).The results showed that the cell proliferation was significantly higher in all groups with additional ABPS at 24 h and 72 h(P＜0.05)time point,900 and 1 200 μg/mL ABPS group were significantly higher than the control group(P＜0.05).In conclusion,ABPS can significantly promote the proliferation of IPEC-J2 under normal culture conditions,and significantly alleviate the inhibition of IPEC-J2 proliferation by LPS.In the study,ABPS with the concentration of 1 200 μg/mL was the best.

Key wordsAchyranthes bidentata polysaccharide;IPEC-J2;LPS;proliferation

牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS）是从苋科植物牛膝的根中提取、分离和纯化的水溶性小分子中性多糖[1-2]。ABPS因具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强免疫和降血糖等多种生物学功能，因此逐渐成为当前营养学研究热点[3]。肠道是机体消化和营养吸收的主要器官，参与机体能量代谢调节；也是机体免疫系统的重要组成部分，能阻止病原微生物、代谢废物从肠腔侵入机体[4]。肠上皮细胞位于肠腔表面，是肠黏膜物理屏障的主要组成部分，也能感知和响应微生物刺激来加强其屏障功能，参与和协调适当的免疫应答[5]。本试验采用的仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）是分离自新生仔猪空肠中段的柱状上皮细胞[6]。动物试验的研究结果表明，ABPS能提高仔猪肠道吸收能力，缓解脂多糖（LPS）免疫应激所导致的肠道吸收功能下降[7-9]。秦文雅研究表明，ABPS能通过改善机体的免疫功能来增强仔猪的肠功能[10]。为了进一步探讨ABPS对仔猪肠道上皮细胞功能的影响，采取细胞培养方式研究ABPS对肠上皮细胞增殖的影响很有必要。为此，本试验考察正常或LPS诱导的免疫应激模型中ABPS对体外培养的IPEC-J2增殖的影响，为推广ABPS在猪生产上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2016年9—10月在湖南农业大学动科楼细胞实验室进行。

1.2 材料

1.2.1 细胞株 仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2），中国科学院亚热带农业生态研究所惠赠。

1.2.2 主要药品与试剂 牛膝多糖购自西安天瑞科技生物有限公司，纯度98%。DMEM/F12细胞培养基、0.25%猪胰蛋白酶、双抗试剂购自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）、细胞冻存液购自Gibco公司。中性磷酸缓冲液（PBS）购自Biotopped公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与细胞计数 选用4～5代的IPECJ2，培养在含有 DMEM/F12培养基（含10%FBS、1%双抗）的培养皿中，置于二氧化碳（CO）2培养箱（37℃、5%CO2、95%湿度）内培养。IPEC-J2培养到对应的时间点，首先采用预热后的PBS洗涤3次，然后采用预热后的0.25%胰蛋白酶消化细胞3 min，加入DMEM/F12培养基终止反应，将细胞置于细胞计数板上通过显微镜统计细胞密度。

1.3.2 ABPS对IPEC-J2的增殖 取处在对数生长期的IPEC-J2细胞，在基础培养基（DMEM/F12）中分别混入 0、600、900 和 1 200 μg/mL 的 ABPS，每个处理12个重复（一个12孔板），每孔为1个重复，每孔接种 1.0×105个/mL 的细胞。在 24 h、48 h、72 h时间点，分别对细胞计数。

1.3.3 LPS对IPEC-J2的增殖 取处在对数生长期的IPEC-J2细胞，在基础培养基（DMEM/F12）中分别混入 0.01、0.1、1、10 和 100 μg/mL 的 LPS，每个处理12个重复（一个12孔板），每孔为1个重复，每孔接种 1.0×105个/mL 的细胞。在 24 h、48 h、72 h时间点，分别对细胞计数。

1.3.4 ABPS对LPS免疫应激下IPEC-J2的增殖取处在对数生长期的IPEC-J2细胞，在基础培养基（DMEM/F12） 中分别混入 0、600、900、1 200 μg/mL的ABPS和10 μg/mL的LPS，每个处理12个重复（一个12孔板），每孔为1个重复，每孔接种1.0×105个/mL的细胞。在24 h、48 h、72 h时间点，分别对细胞计数。

1.4 统计分析

所有数据采用Excel进行整理，用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，用Duncan氏法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度ABPS对正常培养条件下IPEC-J2增殖的影响

由表1可知，IPEC-J2经不同浓度ABPS培养24 h，1 200 μg/mL ABPS组对细胞的增殖效果显著高于其他组（P＜0.05），600 和 900 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果和对照组无显著差异（P＞0.05），但添加效果要优于对照组；细胞培养48 h，600、900和1 200 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果显著高于对照组（P＜0.05）；细胞培养 72 h，600、900 和1 200 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果显著高于对照组（P＜0.05）。

表1 不同浓度ABPS对正常培养条件下IPEC-J2增殖的影响 ×105个/mL

2.2 不同浓度LPS对IPEC-J2增殖的影响

由表2可知，IPEC-J2经不同浓度L PS培养，0.01 μg/mL LPS组对细胞增殖的抑制作用最小，100μg/mL LPS组导致细胞过度应激死亡，LPS对细胞增殖的抑制效果随LPS浓度的升高而增强。本试验IPEC-J2对LPS最大耐受度为10 μg/mL，以此浓度的LPS建立免疫应激模型。

表2 不同浓度LPS对IPEC-J2增殖的影响 ×105个/mL

2.3 不同浓度ABPS对LPS诱导的免疫应激模型中IPEC-J2增殖的影响

由表3可知，LPS免疫应激下IPEC-J2经不同浓度 ABPS 培养 24 h，600、900 和 1 200 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果显著高于对照组（P＜0.05）；培养48 h，900和1 200 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果显著高于对照组（P＜0.05），增殖效果与ABPS浓度呈正相关，600 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果要优于对照组，但差异不显著（P＞0.05）；培养 72 h，600、900和1 200 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果显著高于对照组（P<0.05）。

表3 不同浓度ABPS对LPS免疫应激下IPEC-J2增殖的影响 ×105个/mL

3 讨论

3.1 不同浓度ABPS对正常培养条件下IPEC-J2增殖的影响

本试验结果表明，正常培养条件下IPEC-J2培养24 h，1 200 μg/mL ABPS组细胞的增殖效果显著高于其他组（P<0.05）；培养 48 h和 72 h，600、900和1 200 μg/mL ABPS组细胞增殖效果显著高于对照组（P<0.05）。有研究表明，牛膝多糖能有效促进细胞增殖。邹云等[11]试验表明，ABPS可提高仔猪淋巴细胞转化率；陈清华等[12]研究也表明，ABPS有提高仔猪淋巴细胞增殖的作用。细胞增殖实质就是细胞分裂，真核细胞分裂周期分为4个时相：G1期，DNA合成前期；S期，DNA合成期；G2期，DNA合成后期；M期，分裂期。其中G1期是决定细胞是否能够继续通过周期或撤回的关键期，只有一次通过G1/S时相转换，细胞才能继续增殖[13]。细胞周期的每个时相由各种细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）及其调节亚基（细胞周期蛋白）的活性调控[14]。在G1期期间，细胞周期蛋白D1是与CDK4或CDK6相关的关键细胞周期调节蛋白，调控细胞周期的进程[15-16]。Yu等[17]研究发现，ABPS能通过促进G1/S时相转换和上调细胞周期蛋白D1、CDK4和CDK6的表达，有效促进细胞增殖。Wnt/β-catenin信号通路对细胞增殖的调节非常重要，当Wnt蛋白结合Frizzled家族受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）5/6时，Wnt/β-catenin信号通路被激活，这导致dishevelled（Dvl）家族蛋白的激活[18-19]。Dvl的活化导致GSK-3β的抑制，其导致非磷酸化的β-catenin在细胞质中积累并迁移至细胞核。随后，β-连环蛋白与转录因子相互作用，从而改变Wnt/β-catenin信号传导靶基因的表达，如细胞周期蛋白D1等[20]。Weng等[21]试验结果表明，ABPS 能激活 Wnt/β-catenin信号通路，并通过抑制GSK-3β促进非磷酸化βcatenin转移到细胞核中以增强细胞周期蛋白D1的表达。

3.2 不同浓度LPS对IPEC-J2增殖的影响

本试验结果显示，LPS能有效抑制IPEC-J2的增殖效果，0.01 μg/mL LPS组对细胞增殖的抑制作用最小，100 μg/mL LPS组导致细胞过度应激死亡，LPS对细胞增殖的抑制效果随LPS浓度的升高而增强。在本试验中，IPEC-J2对LPS的最大耐受浓度为10 μg/mL。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，能通过结合TLR4和激活各种蛋白激酶信号通路导致NF-κB核转位，调控多种炎症因子基因及免疫相关基因的表达，产生一系列炎症细胞因子和免疫因子，从而诱导细胞产生免疫应激[22-24]。孙丽等[25]通过0.1和1 μg/mL LPS诱导处理IPEC-J2发现，高浓度LPS处理后TLR4信号通路各基因mRNA表达量显著高于低浓度LPS处理后各基因mRNA表达量。Yang 等[26]用 1 μg/mL LPS 刺激 IPEC-J2，发现 TNF-α和IL-6 mRNA表达量显著增加。高侃[27]研究表明，1 μg/mL LPS刺激IPEC-J2导致细胞致炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的基因表达量显著升高。以上研究表明，较高浓度的LPS使IPEC-J2更快速地产生炎症反应，可能导致细胞过度应激而受损或凋亡，影响细胞的正常增殖。因此用其建立免疫应激模型来研究ABPS对免疫应激下IPEC-J2增殖的影响具有代表性。

3.3 不同浓度ABPS对LPS诱导的免疫应激模型中IPEC-J2增殖的影响

本试验研究表明，LPS免疫应激下IPEC-J2培养 24 h，600、900 和 1 200 μg/mL ABPS 组细胞增殖效果显著高于对照组（P<0.05）；培养 48 h，900和1 200 μg/mL ABPS组细胞增殖效果显著高于对照组（P<0.05）；培养 72 h，600、900 和 1 200 μg/mL ABPS组细胞增殖效果显著高于对照组（P<0.05），表明ABPS能显著缓解LPS对IPEC-J2增殖抑制。有研究表明，ABPS可能是通过降低炎症因子的分泌来缓解LPS应激导致的细胞炎症损伤和增殖抑制。张立国等[28]研究表明，川牛膝多糖具有良好的细胞抗炎、免疫调节及促进细胞修复等活性。刘玉兰等[29]研究也表明ABPS具有一定的缓解炎症的作用。张文俊[8]研究发现，在仔猪饲粮中添加ABPS能有效降低LPS刺激导致的TNF-α含量上升。朱惠玲等[30]试验也得出一致结果，ABPS能显著缓解LPS刺激导致的细胞炎症因子分泌量上升。ABPS属于植物多糖，有研究表明，在LPS免疫应激下植物多糖可能通过TLR4信号通路来抑制NF-κB活化，发挥其抗炎免疫作用。袁媛等[31]试验表明，黄芪多糖能显著抑制LPS刺激小肠上皮细胞分泌产生的TNF-α和IL-8 mRNA的表达量增高，并能降低NF-κB的表达活性。武剑[32]研究发现，柴胡多糖可显著降低LPS诱导细胞的TLR4表达及NF-κB磷酸化水平增高。王雪等[33]发现沙棘多糖提取物能有效抑制LPS/D-Gal N诱导的TLR4的表达。ABPS有可能也是通过TLR4信号通路来发挥抗炎免疫作用，有效缓解LPS对IPEC-J2增殖抑制。

4 结论

ABPS能显著促进正常培养条件下IPEC-J2增殖，也能显著缓解LPS对IPEC-J2增殖的抑制。本试验中，1 200 μg/mL ABPS添加效果最好。

[1] 陈清华，刘祝英，贺建华.牛膝多糖的生物学功能及作用机制研究进展[J] .饲料研究，2008（9）：8-11.

[2] Tan Feng,Deng Jun.Analysis of the constituent and antisenile function of achyranthes bidentata polysaccharides[J] .Acta Botanica Sinica,2002,44(7):795-798.

[3] 时春娟，周永达，张剑波，等.牛膝多糖研究进展[J] .中国新药杂志，2006，15（16）：1330-1334.

[4] Alizadeh A,Akbari P,Diflippo E,et al.The piglet as a model for studying dietary components in infant diets:effects of galacto-oligosaccharides on intestinal functions[J] .British Journal of Nutrition,2016(4):1-14.

[5] Peterson L W,Artis D.Intestinal epithelial cells:regulators of barrier function and immune homeostasis[J] .Nature Reviews Immunology,2014,14(3):141-153.

[6] Brosnahan A J,Brown D R.Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations[J] .Veterinary Microbiology,2012,156(3-4):229-237.

[7] 陈清华，贺建华，刘祝英.牛膝多糖对仔猪肠道微生物及小肠黏膜形态的影响 [J] .湖南农业大学学报：自然科学版，2007，33（6）：723-726.

[8] 张文俊.牛膝多糖对脂多糖应激断奶仔猪生长性能、免疫功能和肠道功能的影响[D] .长沙：湖南农业大学，2011.

[9] 任芬芬.牛膝多糖对仔猪各肠段微生物多样性影响的研究[D] .长沙：湖南农业大学，2012.

[10] 秦文雅.牛膝多糖对免疫应激仔猪肠道的影响及其作用机理[D] .长沙：湖南农业大学，2012.

[11] 邹云，谢红兵，禹琪芳，等.植物多糖对断奶仔猪淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的影响 [J] .动物营养学报，2014，26（1）：210-218.

[12] 陈清华，刘祝英，贺建华.牛膝多糖对仔猪淋巴细胞增殖作用和细胞因子分泌量的影响[J] .动物营养学报，2008（6）：712-717.

[13] Zhang M,Xie R,Hou W,et al.PTHrP prevents chondrocyte premature hypertrophy by inducing cyclin-D1-dependent Runx2 and Runx3 phosphorylation,ubiquitylation and proteasomal degradation[J] .Journal of Cell Science,2009,122(9):1382-1389.

[14] Golias C H,Charalabopoulos A,Charalabopoilos K.Cell proliferation and cell cycle control:a mini review[J] .International Journal of Clinical Practice,2004,58(12):1134-1141.

[15] Blagosklonny M V,Pardee A B.The restriction point of the cell cycle[J] .Cell Cycle,2002,1(2):103-110.

[16] Li X,Ye H,Yu F,et al.Millimeter wave treatment promotes chondrocyte proliferation via G1/S,cell cycle transition[J] .International Journal of Molecular Medicine,2012,29(5):823-831.

[17] Yu F,Li X,Cai L,et al.Achyranthes bidentata polysaccharides induce chondrocyte proliferation via the promotion of the G1/S cell cycle transition[J] .Mol Med Rep,2013,7(3):935-940.

[18] Tao H Y,He B,Liu S Q,et al.Effect of carboxymethylated chitosan on the biosynthesis of NGF and activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in the proliferation of Schwann cells[J] .European Journal of Pharmacology,2013,702(1-3):85-92.

[19] Mac Donald B T,Tamai K,He X.Wnt/beta-catenin signaling:components,mechanisms,and diseases[J] .Developmental Cell,2009,17(1):9-26.

[20] Kim W,Kim M,Jho E.Wnt/β-catenin signalling:from plasma membrane to nucleus[J] .Biochemical Journal,2013,450(1):9-21.

[21] Weng X,Lin P,Liu F,et al.Achyranthes bidentata polysaccharides activate the Wnt/beta-catenin signaling pathway to promote chondrocyte proliferation[J] .Int J Mol Med,2014,34(4):1045-1050.

[22] Palssonmcdermott E M,O'Neill L A.Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor,Toll-like receptor-4[J] .Immunology,2004,113(2):153-162.

[23] Abe-Yutori M,Chikazawa T,Shibasaki K,et al.Decreased expression of E-cadherin by Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide attenuates epithelial barrier function[J] .Periodontal Res,2016,52(1):42-50.

[24] Grinnell K L,Chichger H,Braza J,et al.Protection against LPS-induced pulmonary edema through the attenuation of protein tyrosine phosphatase-1B oxidation[J] .Am J Respir Cell Mol Biol,2012,46(5):623-632.

[25] 孙丽，夏日炜，殷学梅，等.LPS诱导条件下猪小肠上皮细胞TLR4及其信号通路基因表达变化分析 [J] .畜牧兽医学报，2015，46（7）：1095-1101.

[26] Yang F,Wang A,Zeng X,et al.Lactobacillus reuteri I5007 modulates tight junction protein expression in IPEC-J2 cells with LPS stimulation and in newborn piglets under normal conditions[J] .BMC Microbiology,2015,15(1):1-11.

[27] 高侃.乳酸杆菌对LPS致敏小肠上皮细胞的免疫调节效应及机制研究[D] .杭州：浙江农林大学，2015.

[28] 张立国，赵丽丽，倪力军，等.以多糖为主要部位的6种腰痛宁衍生方对巨噬细胞中炎症因子表达及软骨细胞增殖的影响[J] .中草药，2015，46（24）：3710-3716.

[29] 刘玉兰，郭广伦，吴志锋，等.牛膝多糖对脂多糖免疫应激仔猪血液生化指标和白细胞分类计数的影响[J] .中国饲料，2010（2）：35-38.

[30] 朱惠玲，刘玉兰，郭广伦，等.牛膝多糖对免疫应激仔猪生长性能、炎性介质和内分泌激素的影响[J] .中国畜牧杂志，2011，47（5）：48-51.

[31] 袁媛，孙梅.黄芪多糖对LPS损伤小肠上皮细胞的保护作用[J] .世界华人消化杂志，2008，16（1）：15-19.

[32] 武剑.柴胡多糖对巨噬细胞免疫功能的调节及对TLR4信号通路的影响[D] .上海：复旦大学，2012.

[33] 王雪，张威，刘欢，等.沙棘多糖提取物对LPS/D-GalN诱导的小鼠肝损伤的保护作用及其对TLR4，SOCS3表达的调控[J] .中国免疫学杂志，2015（11）：1457-1460.

（编辑：富春妮）

Effects of Achyranthes Bidentata Polysaccharides on Intestinal Porcine Epithelial Cells Proliferation in Vitro Culture

WANG Xiong1,LI Mengwei2,CHEN Qinghua1
（1.College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China）

S828

A

1002-1957(2017)05-0013-04

2017-08-21

湖南省教育厅重点项目-牛膝多糖通过TLR4信号通路调控仔猪肠道树突状细胞成熟的研究（项目号：14A067）

王 雄（1991-），男，湖南长沙人，在读硕士研究生，研究方向为饲料资源开发与利用.E-mail:188735129@qq.com

陈清华（1971-），男，湖南邵阳人，教授，博士，主要从事分子营养学与饲料资源开发利用研究工作.E-mail:chqh314@163.com