不同菌种发酵乳品质与抗氧化能力研究

贾亚婷，郭艳梅，蔡逸安，李昕悦，赵玉明，马玲

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；2.山西省生物研究所，太原030006）

不同菌种发酵乳品质与抗氧化能力研究

贾亚婷1，郭艳梅1，蔡逸安1，李昕悦1，赵玉明2，马玲1

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；2.山西省生物研究所，太原030006）

研究了由不同菌种制作的酸奶发酵乳在冷藏期21 d内品质、抗氧化活性的变化，研制具有高抗氧化活性的发酵乳。通过对比传统发酵乳与两种益生菌发酵乳贮藏期的pH值、滴定酸度、黏度、持水力、ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和总还原能力等指标，研究益生菌对发酵乳品质和抗氧化活性的影响。结果表明，益生菌发酵乳在维持酸奶品质、延长市场货架期方面优于传统发酵乳，在冷藏期21 d内三种菌种发酵乳DPPH自由基清除能力和还原能力均有明显的增加（P＜0.05），动物双歧杆菌BB-12发酵乳A700nm最高达0.481±0.06。在冷藏期1～7 d益生菌发酵乳ABTS自由基清除能力明显高于传统发酵乳。

发酵乳；菌种；冷藏；品质；抗氧化活性

Abstract:In order to develop yoghurt with higher antioxidant activity,the properties and antioxidant changes of yoghurts made with differ⁃ent starter strains in 21 days cold(4℃)storage periods were determined,Indexes of pH,acidity,viscosity,water-holding power,ABTS free radical scavenging ability,DPPH free radical scavenging rate and total reducing power were investigated for both the traditional fermented milk and two kinds of probiotic fermented milk during cold(4℃)storage.The results showed that the probiotic fermented milk in mainting the yogurt quality,extend the shelf life of the products was better than the traditional fermented milk,all samples for DPPH radical scaveng⁃ing ability and reducing power has increased significantly during the 21 d cold storage(P＜0.05),the reduce power for BB-12 fermented milk as higher as up to 0.481± 0.06.the ABTS free radical scavenging ability for probiotic fermented milk was significantly higher than the tradi⁃tional fermented milk in 1～7 d cold storage.

Key words:yoghurt;strains;cold storage;quality;antioxidant activity

0 引言

乳酸菌作为一种天然的抗氧化剂，具有抗癌、降低胆固醇、治疗各种胃肠道疾病及增强免疫力等的作用[1]，同时乳酸菌介导的发酵可以提高食品的风味和营养价值。因此，发酵乳添加益生菌后可以将菌种的保健作用与发酵乳的健康功效完美结合起来。

目前相关方面也有一些研究，张睿[2]等的研究结果表明在贮藏期21 d内，添加干酪乳杆菌与植物乳杆菌的益生菌发酵乳在硬度、稠度、黏度与凝聚性上与传统发酵乳相比均有所增加。赵志文[3]等研究了单一及组合乳酸菌发酵乳对体外抑菌、抗氧化和降胆固醇等功能的影响，结果表明混合乳酸菌清除超氧阴离子的能力强于各组单菌株发酵乳。本研究将比较分别由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌1∶1组成的混合发酵剂、动物双歧杆菌BB-12、嗜酸乳杆菌LA-14制备的发酵乳在冷藏期21 d内的品质及抗氧化活性，为进一步开发新型高抗氧化活性发酵乳提供导向和理论依据。

1 实 验

1.1 材料试剂

生鲜牛乳，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等菌种（山西农业大学食品科学与工程学院畜产品加工实验室保存），蔗糖(市售)，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)ABTS,1,1-二苯基-2-苦肼基（自由基）DPPH，TCI原装；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-2FD超净工作台，HPP-9272电热恒温培养箱，0～4℃冰箱，ST2100pH计，NDJ-1指针式黏度计，FA2004电子分析天平，LD5-2B低速离心机，7200型分光光度计，XH-C漩涡振荡器，恒温水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将生鲜牛乳灭菌，冷却至室温后，分装至灭菌后的试管中，然后分别接种保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌BB-12、嗜酸乳杆菌LA-14冻干粉，置于恒温培养箱中进行凝乳培养，反复传代，直到符合生产发酵剂要求。

1.3.2 发酵乳的加工工艺流程

原料奶→均质→加糖→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→后熟

接种3%由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌按1∶1组成的混合发酵剂制作的发酵乳记为LB+ST，接种3%动物双歧杆菌BB-12发酵剂制作的发酵乳记为BB12，接种3%嗜酸乳杆菌LA-14发酵剂制作的发酵乳记为LA14。

pH值直接用ST2100pH计测定；黏度采用NDJ-1指针式黏度计测定。

1.3.3 酸度的测定[4]

取10 g发酵乳于三角瓶中，加入20 mL蒸馏水，滴入2～3滴酚酞指示剂，用浓度为0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定，不断轻微摇动，直至微红色在30 s内不消失为止。样品的酸度按下面公式计算：

式中：c为标准氢氧化钠的浓度（mol/L）；V为滴定所消耗标准氢氧化钠的体积（mol/L）；m为样品质量（g）；0.1为酸度理论定义NaOH的摩尔浓度（mol/L）。

1.3.4 发酵乳持水力的测定[5]

准确称量一定质量样品于离心管中，转速为4 000 r/min离心10 min后，去除上清液后称重。样品的保水性按下式计算：

式中:m1为离心前所称取样品质量（g）；m2为离心后去掉上清液样品质量（g）。

1.3.5 发酵乳抗氧化性的测定

样品处理：将待测发酵乳与蒸馏水以体积比1:2的比例混匀配置成样品溶液，按照如下方法分别测定三项抗氧化指标。

（1）ABTS自由基清除能力

参考Linghong Liang[6]等的方法并略作改动。将浓度为7 mmol/L的ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾混匀在室温避光条件下放置12～16 h，形成ABTS储备液。ABTS储备液用磷酸盐缓冲溶液PBS（0.1 mol/L,pH=7.4）稀释使其在734 nm波长处吸光值为0.70±0.02。吸取0.5 mL待测样品于反应试管中，然后加入5 mL的ABTS稀释液，用漩涡振荡器充分混匀，暗处反应6 min,于734 nm波长处测反应液吸光值。

式中：AS为样品吸光值；AC为对照组吸光值，即用同体积PBS代替ABTS稀释液；Ab为样品空白组吸光值。

（2）DPPH自由基清除能力

参考Linghong Liang[6]等的方法并略作改动。将1 mL待测样品与5 mL 0.1 mmol/L DPPH混合均匀，室温下放置暗处反应30 min，在517 nm波长处测其吸光值。

式中：AS为样品吸光值；AC为对照组吸光值，即用同体积无水乙醇代替DPPH；Ab为样品空白组吸光值。

（3）总还原能力的测定

[7-8]中的方法并略作改动。将1 mL待测样品与2 mL磷酸盐缓冲溶液PBS（浓度0.2 mol/L，pH=6.6），2 mL质量浓度为10 g/L铁氰化钾混合后放于50℃恒温水浴中20 min。反应后加入2 mL质量浓度为100 g/L的TCA混匀后离心（4 000 r/min,10 min），取上清液4 mL加入0.5 mL质量浓度为1 g/L的FeCl3.混合液放置室温反应至溶液澄清后在600 nm处测吸光值。吸光值越大，表明抗氧化能力越大。

2 结果与分析

2.1 发酵乳的贮藏特性研究

2.1.1 冷藏期间产酸能力的测定结果

图1为传统乳酸菌LB+ST、动物双歧杆菌BB-12、嗜酸乳杆菌LA-14发酵乳冷藏期酸度的变化趋势；图2为冷藏期21 d pH值的变化趋势。

图1 不同菌种发酵乳冷藏期滴定酸度的变化趋势

图2 不同菌种发酵乳冷藏期pH的变化趋势

由图1和图2可以看出，不同菌种产酸能力差异较大。在发酵初期（即冷藏1～7 d），LB+ST，BB12，LA14滴定酸度均明显增加，且pH值的变化趋势正好相反，这是由于在冷藏初期，菌种具有较强的代谢乳糖从而产酸的能力，酸度增加幅度较大。随着冷藏期的延长，滴定酸度增加趋势和pH下降趋势均逐渐平缓，这可能是酸性物质增加抑制菌种的代谢产酸所致。酸度是衡量酸奶保质期的一个重要指标，由图1可以看出，在冷藏1～7 d，传统发酵乳酸度由67.5°T上升到98.5°T，变化幅度为31.0°T，而BB12和LA14分别由56.7°T上升到77.0°T、56.8°T上升到78.0°T，变化幅度分别为20.3°T和21.2°T。即在相同的冷藏条件下，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌发酵乳的产酸速度均低于传统发酵乳，后酸化程度弱，这样较好的保存了酸乳特征口味的稳定，有利于延长酸乳市场货架期。

2.1.2 冷藏期间黏度、持水力的测定结果

由图3可以看出，在21 d冷藏期间LB+ST、BB12、LA14的黏度变化趋势均是先增大后减小。LA14黏度在冷藏第7 d达到最大值，之后下降，LB+ST和BB12黏度在冷藏第14天达到最大值后缓慢下降。在冷藏期21 d内，与LB+ST、LA14比较，BB12发酵乳黏度变化较为缓慢，这可能与菌种的稳定性及自身代谢有关[9]。图4为LB+ST，BB12，LA14冷藏期持水力的变化趋势。

图3 不同菌种发酵乳冷藏期黏度的变化趋势

图4 不同菌种发酵乳冷藏期持水力的变化趋势

由图4可以看出，在冷藏期21 d内，三种菌种持水力均呈现下降趋势。这可能是因为在发酵乳冷藏期间菌种不断代谢需要水的参与[10]，也可能与发酵乳冷藏过程中较低的pH值环境破坏了凝胶体的结构有关。BB12和LA14持水力均呈现先增大后减小的趋势。BB12在冷藏1～7 d内持水力不断增加，第7 d时达最大值61.80%，随后持水力下降，在冷藏第21 d时达最小值47.84%。LA14在冷藏1～7 d内持水力由56.50%上升至66.90%，之后不断下降，第21天时持水力达最小值50.69%。传统乳酸菌发酵乳在冷藏期21 d内持水力下降不明显。BB12和LA14在冷藏1～14 d内持水力均大于传统乳酸菌发酵乳，因此从持水力的角度来看，在一定保质期内，益生菌发酵乳品质优于传统发酵乳。

2.2 发酵乳的抗氧化性活性测定结果

2.2.1 ABTS自由基清除能力的测定结果

ABTS法目前已被广泛的应用于抗氧化剂的体外抗氧化活性测定。在反应体系中，ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色的水溶性自由基ABTS+，抗氧化剂与ABTS+反应后使反应体系褪色，体系褪色越明显表示被测物质的抗氧化性活性越强。在ABTS自由基的特征吸收波长下（734 nm）检测吸光度的变化，能反应抗氧化剂清除ABTS自由基活性的高低[11]。

由表1可知，LB+ST在冷藏期21 d内，ABTS自由基清除率的变化范围为（52.84%±0.17%）～（85.98%±0.30%），抗氧化活性有明显的增加（P＜0.05）；发酵乳BB12在冷藏期21d内，ABTS自由基清除率的变化范围为（70.15%±0.11%）～（96.17%±0.16%），抗氧化活性有明显的增加（P＜0.05）；发酵乳LA14在冷藏期21d内，抗氧化活性无显著变化（P＞0.05）。由表1可知，在冷藏期第1 d和第7 d时，动物双歧杆菌BB-12和嗜酸乳杆菌LA-14发酵乳均具有较强的ABTS自由基清除能力，与传统菌种酸乳LB+ST相比差异显著（P＜0.05）。

2.2.2 DPPH自由基清除能力的测定结果

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在乙醇溶液中形成一种紫红色的稳定的自由基，且在特征吸收波长下（734 nm）具有典型的吸收峰。当体系中存在抗氧化剂时，抗氧化剂提供氢电子和原子给DPPH自由基，使其生成无色产物，导致溶液的特征吸收峰值下降，吸光值变小。在此反应中，在734 nm下检测反应体系吸光值的变化，能反应被检测物质抗氧化能力的强弱[12]。

由表1可以看出，在冷藏期1～21 d内发酵乳的DPPH自由基清除能力均有明显的增加（P＜0.05），LB+ST、BB12、LA14发酵乳的增加趋势几乎一致。LB+ST在冷藏期第7 d时DPPH自由基清除率有明显的增加（P＜0.05），在第21 d时达到最大值84.24%±0.14%；BB12在冷藏期第1～14 d内变化范围为（61.11±0.25）～（97.26±0.18），抗氧化活性明显增加（P＜0.05）；LA14在冷藏期第21 d达到最大值82.14±0.30，抗氧化活性明显增加（P＜0.05）。在同一冷藏期三种不同菌种的清除DPPH能力无显著差异（P＞0.05）。

2.2.3 还原能力的测定结果

抗氧化剂的还原能力与抗氧化活性成正相关。根据还原力的测定方法，A700nm越大，则抗氧化剂的还原能力越强，即抗氧化活性越强[13]。由表1可以看出，无论传统发酵乳还是益生菌发酵乳，还原能力随着冷藏期的延长均呈增强的趋势。在冷藏期第14天和第21 d时，发酵乳BB12的还原力明显高于LB+ST和LA14（P＜0.05），其A700nm最高达0.481±0.06。

表1 发酵乳冷藏期抗氧化活性测定结果

唐雪梅[14]研究了干酪乳杆菌胞外多糖的抗氧化性能，结果表明随着干酪乳杆菌胞外多糖浓度的增大，对DPPH自由基的清除率也增大。T.Amatayakul等[15]的研究由牛奶添加不同比例酪蛋白和乳清蛋白制作的酸奶在4℃冷藏21 d内的胞外多糖浓度变化，发现在冷藏期21 d内胞外多糖的浓度均有所增加。王曦等[11]对35株乳酸菌的菌体、无细胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力进行研究，结果表明抗氧化活性物质较多分布在胞外分泌物中。本研究结果表明三种不同菌种发酵乳在21 d冷藏期抗氧化活性均增强。由此推测引起发酵乳中起抗氧化作用的物质主要是胞外多糖，其具体作用机制还需要进一步研究阐明。Vaya Chouchouli等[16]以DPPH自由基清除率和还原能力为指标，研究乳酸菌发酵乳在冷藏32 d内的抗氧化活性，结果表明随着贮藏期的延长DPPH自由基清除率降低，而还原能力在贮藏1～21 d时先增加后降低。与本研究存在差异，推测原因可能是发酵乳制作工艺的不同及菌种配比不同。

3 结论

（1）本研究主要研究了不同菌种发酵乳在4℃冷藏21 d的pH值、酸度、粘度与持水力的变化。结果表明传统发酵乳和益生菌发酵乳的酸度随冷藏期的延长均增加，而pH值、黏度与持水力均降低，发现益生菌发酵乳的后酸化程度较传统发酵乳弱，黏度、持水力变化程度弱（P＜0.05），其在维持酸奶品质、延长市场货架期方面优于传统发酵乳。

（2）以ABTS自由基清除率为指标测定时，在4℃冷藏第1天和第7 d BB12和LA14的自由基清除率大于LB+ST，在第21 d BB12的自由基清除率大于LB+ST和LA14；从DPPH自由基清除率的结果来看，在冷藏第7 d BB12和LA14的自由基清除率大于LB+ST；还原力的测定结果可以看出，在冷藏第1天BB12和LA14的抗氧化活性大于LB+ST，在冷藏第14 d和第21 d时BB12的抗氧化活性大于LB+ST和LA14（P＜0.05）。综合以上三个测定指标，益生菌发酵乳的抗氧化活性在一定的贮藏期内强于传统发酵乳，具有较好的市场前景，也为进一步开发新型高抗氧化活性发酵乳提供了依据。

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Research of quality and antioxidant capacity for fermented milk with different strains

JIA Yating1，GUO Yanmei1，CAI Yian1，LI Xinyue1，ZHAO Yuming2,MA Ling1
（1.College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;2.Biology Institute of Shanxi,Taiyuan 030006,China）

TS252.54

A

1001-2230（2017）09-0022-04

2017-02-28

山西省大学生科技创新项目（201610113045）；山西省重点研发计划重点项目（201603D21108-02）。

贾亚婷（1995-），女，本科，研究方向为食品质量与安全。

马玲