非小细胞肺癌中PHF20与凋亡相关蛋白Bax的表达及相关性

姜西子，金艾琳，马琳，唐娜，张清富，孙丽梅，邱雪杉

（中国医科大学1. 附属第一医院病理科，沈阳 110001； 2. 基础医学院病理教研室，沈阳 110122）

非小细胞肺癌中PHF20与凋亡相关蛋白Bax的表达及相关性

姜西子1，2，金艾琳1，2，马琳1，2，唐娜1，2，张清富1，2，孙丽梅1，2，邱雪杉1，2

（中国医科大学1. 附属第一医院病理科，沈阳 110001； 2. 基础医学院病理教研室，沈阳 110122）

目的探讨化疗前非小细胞肺癌中PHF20与Bax的表达差异及其相关性。方法采用免疫组化方法检测PHF20与Bax在非小细胞肺癌中的表达情况，分析PHF20的临床意义以及PHF20与Bax可能存在的相关性。结果非小细胞肺癌中PHF20蛋白在细胞质中表达。PHF20在鳞癌中高表达，在腺癌中低表达，并与细胞分化程度、TNM分期和淋巴结转移密切相关。肺鳞癌中PHF20和Bax的表达呈正相关。结论非小细胞肺癌中PHF20的表达变化与肿瘤进展密切相关，而且与Bax表达存在相关性，其具体机制的研究将很可能为非小细胞肺癌的治疗提供新的靶点。

非小细胞肺癌；PHF20；Bax

Abstract ObjectiveTo investigate the differences in the expression of PHF20 and Bax and their correlations in non-small cell lung cancer before chemotherapy.MethodsAn immunohistochemical method was used to detect the expression of PHF20 and Bax in nonsmall cell lung cancer，and to analyze the clinical significance of PHF20 and the possible correlation between PHF20 and Bax proteins.ResultsPHF20 protein is expressed in the cytoplasm of non-small cell lung cancer cells. Moreover，it is highly expressed in squamous cell carcinoma，less expressed in adenocarcinoma，and closely related with cell differentiation，TNM staging，and lymph node metastasis.The expression of PHF20 and Bax was positively correlated with squamous cell lung carcinoma.ConclusionThe expression of PHF20 in non-small cell lung cancer is closely associated with tumor progression and the expression of Bax. PHF20 may be a new target for the treatment of non-small cell lung cancer.

Keywordsnon-small cell lung cancer； PHF20； Bax

肿瘤的发生发展与细胞增殖和凋亡平衡失调（特别是凋亡的抑制）相关。具有植物同源结构域的锌指蛋白20（PHF20），作为新发现的1个转录因子，表现出肿瘤抑制因子的活性［1］。PHF20蛋白含有多个功能域，其第2个Tudor区域可识别并结合p53，结合后会通过阻止p53的泛素化而稳定和并促进p53的活性转录［2］。Akt可以磷酸化PHF20，使其从细胞核转移到细胞质，从而丧失稳定p53的功能［3］。

Bax蛋白作为主要促凋亡蛋白，能通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡进而影响细胞状态［4］。在依赖p53的细胞凋亡中，Bax蛋白表达明显受到p53的促进［5］。研究［5］证明体外RNA干扰特异性敲除PHF20，可以使p53蛋白及下游Bax凋亡蛋白显著下调，在p53缺失的细胞系中，PHF20敲除后Bax也显著下降；上调PHF20后可明显抑制细胞增殖和存活。本研究通过检测非小细胞肺癌中PHF20和Bax的表达情况，分析PHF20的临床意义及PHF20与Bax的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2008年1月至2012年2月中国医科大学附属第一医院病理科的原发性肺癌标本共195例，并以距离肿块5 cm的正常肺组织30例作为对照。所有标本经2名病理医师根据2009年肺癌TNM分期系统和WTO肺癌分类标准，确定组织类型、细胞分化以及临床病理分期。所有患者术前均未接受放、化疗。患者年龄27～78岁，平均年龄58.2岁。其中鳞癌101例，腺癌94例；高分化73例，中分化72例，低分化50例；有淋巴结转移者99例，无淋巴结转移者96例；Ⅰ期79例，Ⅱ期68例，Ⅲ期32例，Ⅳ期16例。本研究已获本单位伦理委员会批准，并取得受试者的知情同意。

1.2 免疫组织化学染色

将石蜡包埋标本制成4 μm的切片。采用Eli-Vision两步法检测PHF20（1∶75）的表达，链霉素生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测Bax（1∶150）的表达。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。阳性对照采用购自福州迈新公司的阳性片。

1.3 阳性判定标准

细胞质内出现粗细一致的棕黄色颗粒者为阳性染色，光镜下每张切片都选较好的10个视野（400倍），计数1 000个肿瘤细胞。将染色强度分3个等级并计分：浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。将PHF20和Bax蛋白表达百分率分为4个等级：≤25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分。将染色强度和阳性细胞率的分值乘积作为最终评分，分数≥4为阳性表达，＜4为阴性表达。本组HE切片诊断和免疫组化染色结果判读由2名病理医师完成。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件来统计分析，PHF20和Bax蛋白表达与临床病理因素的关系用χ2检验分析，PHF20与Bax蛋白表达的关系用Spearman等级相关分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHF20和Bax在非小细胞肺癌和癌旁组织中的表达

PHF20和Bax蛋白在30例癌旁肺组织中高表达，阳性表达率分别为76.7%（23/30）和83.3%（25/30）；PHF20和Bax蛋白在195例非小细胞肺癌组织中表达降低，阳性表达率分别为44.6%（87/195）和62.6%（122/195），两者都是胞质表达。统计结果显示，在癌旁肺组织和肺癌组织中PHF20蛋白（P = 0.002）和Bax蛋白（P = 0.042）的表达均有统计学差异。

2.2 PHF20和Bax蛋白表达与肺癌临床病理因素的关系

195例非小细胞肺癌中，PHF20和Bax蛋白表达情况与肺癌临床病理因素具有相关性，见表1。PHF20和Bax蛋白的阳性表达率与细胞分化程度和淋巴结转移情况相关。PHF20和Bax的阳性表达率随着细胞分化程度的降低而显著降低（P分别为0.001和0.002）。在非小细胞肺癌中，伴有淋巴结转移时PHF20和Bax蛋白阳性表达率较无淋巴结转移时明显降低（均P = 0.008）。PHF20蛋白不仅与细胞分化程度和淋巴结转移密切相关，还与组织学分型、TNM分期相关。PHF20蛋白在肺鳞癌中的阳性表达率明显高于肺腺癌中的阳性表达率（P ＜ 0.001），见图1、2。TNM分期中Ⅰ期PHF20蛋白表达率高于Ⅱ～Ⅳ期患者的阳性表达率（P = 0.008）。PHF20和Bax蛋白的表达情况与性别、年龄、肿瘤大小无明显相关性。

2.3 PHF20和Bax蛋白表达的相关性

在101例肺鳞癌组织中，有50例PHF20与Bax蛋白同时出现阳性表达，有28例两者同时出现阴性表达，有10例为PHF20阳性表达而Bax阴性表达，有13例为PHF20阴性表达而Bax阳性表达，经统计分析有统计学差异（P ＜ 0.001），Spearman相关分析表明，PHF20与Bax表达具有正相关性（r = 0.532），见表2。

3 讨论

肺癌是人类最为常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌占到80%～85%。随着人口老龄化与生存环境的污染，肺癌发病率大幅提高，吸烟人群的增加使肺癌发病率进一步升高，但是目前肺癌的早期诊断受到一定程度的限制，肺癌死亡率已经成为恶性肿瘤首位［6］。

PHF蛋白家族主要是含有PHD结构域的锌指蛋白。锌指蛋白与人类多种疾病的发生发展密切相关。PHF20作为多区域蛋白，可以乙酰化p53和组蛋白H4［7］，PHF20是赖氨酸乙酰转移酶复合体的1个亚基［8］。PHF20具有多个功能结构域，其中包括1个AT-hook区域、2个Tudor区域、1个PHD 指状物［9］和1个C2H2锌指。其中，与p53结合的是PHF20的第2个Tudor区域，可以特异性地与Lys370或Lys382甲基化或二甲基化的p53多肽相互作用。由小鼠双微体2（murine double minute-2，Mdm-2）介 导 的p53泛素化的减少正是由于PHF20-p53复合体的形成，从而通过甲基化的方式维持p53的稳定性。PHF20绑定p53的区域也恰恰是大多数Mdm-2泛素化的p53位点C端，从而稳定并促进p53的转录活性，促进细胞凋亡和抑制细胞增殖［2］。研究［10］发现，Akt和p53通路的联系是通过Akt介导Mdm-2磷酸化实现的。PHF20的Ser291被活化的Akt磷酸化，使得PHF20从细胞核移动到细胞质而丧失稳定p53的功能［3］。本研究结果表明，非小细胞肺癌组织中PHF20蛋白的阳性表达率较癌旁肺组织少，且其阳性表达率随细胞分化程度的降低而降低；鳞癌中的阳性表达率明显高于

腺癌，说明与肺癌组织学分型有关；伴有淋巴结转移的患者比无淋巴结转移者阳性表达率下降，提示PHF20蛋白具有肿瘤抑制因子的特征。

表1 PHF20和Bax蛋白表达与肺癌临床病理因素的关系Tab.1 The correlation between the expression of PHF20 and Bax proteins and the clinical pathological factors in lung cancer

图1 PHF20和Bax蛋白在肺鳞癌细胞胞质内中的阳性表达 ×200Fig.1 The positive expression of PHF20 and Bax proteins in the cytoplasm of lung squamous cell carcinoma cells ×200

图2 PHF20和Bax蛋白在肺腺癌细胞胞质内中的阳性表达×200Fig.2 The positive expression of PHF20 and Bax proteins in the cytoplasm of lung adenocarcinoma cells ×200

表2 PHF20和Bax蛋白在肺鳞癌中的相关性Tab.2 The association of PHF20 and Bax proteins in lung squamous cell carcinoma

在动物胚胎发育和内稳态的维持中存在细胞凋亡，其调控异常与某些疾病的发生密切相关，尤其是癌症［11］。Bcl-2家族在细胞凋亡中起着重要作用。Bax是促凋亡基因，属于Bcl-2家族，自身可以形成同源二聚体或与Bcl-2结合形成异源二聚体来调控Bcl-2活性［12］，同时参与p53依赖的凋亡信号途径，促进细胞凋亡［4］。Bax蛋白在多种肿瘤的细胞凋亡调节中发挥重要作用，如喉鳞癌［13］、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、直肠癌、睾丸癌等。已有研究［2］证明，利用体外RNA干扰特异性敲除PHF20蛋白，可以下调p53蛋白及p53下游的凋亡蛋白p21和Bax；在p53缺失的细胞系中敲除PHF20蛋白，Bax蛋白仍然显著下降。本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中Bax蛋白的阳性表达率较癌旁肺组织低，Bax蛋白阳性表达率主要与淋巴结转移情况相关，伴有淋巴结转移的患者比无淋巴结转移者阳性表达率减弱，这表明Bax蛋白在肺癌发生发展过程中可能发挥了抑制肿瘤细胞生长增殖以及抑制肿瘤细胞发生转移的作用。本研究结果与MILAS等［14］的报道相一致。而且Spearman分析结果显示在肺鳞癌中PHF20和Bax蛋白表达呈现正相关，进一步提示在非小细胞肺癌中PHF20和Bax蛋白可能存在相互作用来共同调节细胞凋亡。

PHF20和Bax蛋白之间可能存在一定的调控关系，但是肿瘤细胞发生发展是一个多因素的过程，PHF20和Bax蛋白之间是否通过直接作用来调控细胞的生长、增殖和凋亡，以及2种蛋白在肿瘤形成中的关联，PHF20蛋白在腺癌与鳞癌中表达的差异性有待进一步研究。

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（编辑 于 溪）

Expression and Correlation of PHF20 and Apoptosis-associated Protein Bax in Non-small Cell Lung Cancer

JIANG Xizi1，2，JIN Ailin1，2，MA Lin1，2，TANG Na1，2，ZHANG Qingfu1，2，SUN Limei1，2，QIU Xueshan1，2

（1. Department of Pathology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China； 2. Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110122，China）

R734.2

A

0258-4646（2017）10-0887-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.012.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.006

辽宁省教育厅高等学校创新团队（LT2015029）

姜西子（1991-），女，硕士研究生.

孙丽梅，E-mail：limeisun@hotmail.com

2017-03-28

网络出版时间：2017-09-27 14:52