马鞭草总黄酮对肝癌HepG-2细胞IL-6、JAK2、STAT3水平的影响

李永明，李先佳

马鞭草总黄酮对肝癌HepG-2细胞IL-6、JAK2、STAT3水平的影响

李永明1，李先佳2

目的 分析马鞭草总黄酮对人肝癌细胞株HepG-2增殖及IL-6、JAK2、STAT3 mRNA水平的影响。方法 采用不同质量浓度的马鞭草总黄酮处理体外培养的肝癌 HepG-2细胞，Real time PCR检测 IL-6、p-JAK2、p-STAT3表达水平，Western blot法分析JAK2、STAT3蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较，马鞭草总黄酮能显著降低 IL-6、p-JAK2、p-STAT3 mRNA表达水平（均 P＜0.05），下调 JAK2、STAT3蛋白水平（P＜0.05）。结论马鞭草总黄酮下调肝癌HepG-2细胞IL-6、JAK2、STAT3水平，抑制细胞增殖。

肝癌；HepG-2；马鞭草总黄酮；IL-6／JAK2／STAT3

Abstract：Objective To investigate the total flavonoids of Verbena officinalis L（TFV）effect on IL-6、JAK2、STAT3 level of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells. Methods HepG-2 Cells were treated and cultured with different concentrations of TFV.The expression of IL-6、p-JAK2，p-STAT3 mRNA were detected by RT-PCR.Expression of p-JAK2，p-STAT3 protein were analyzed by western blotting.Results Compared with the control group，TFV could significantly decrease the expressions of IL-6，p-JAK2，p-STAT3（all P＜0.05），Moreover，TFV could down-regulate the protein expression of p-JAK2，p-STAT3（P＜0.05）. Conclusion TFV could down-regulate the level of IL-6、JAK2，STAT3 and inhibit the proliferation of HepG-2 cells.

Key words：hepatocellular carcinoma；HepG-2；total flavonoids；Verbena officinalis；IL-6／JAK2／STAT3

马鞭草具有一定的抗癌、抗肿瘤、调节免疫力等作用，而黄酮为其有效的活性成分［1］，本组前期研究显示马鞭草总黄酮（total flavonoids of Verbena officinalis L，TFV）对肝癌HepG-2细胞的增殖具有一定的抑制作用［2］，但机制还不明确。本研究采用马鞭草总黄酮体外干预肝癌HepG-2细胞，观察其对Hep G-2细胞 IL-6／JAK／STAT信号通路的影响，从mRNA和蛋白质水平研究其对IL-6、JAK2、STAT3表达的影响，为新药的开发及抗癌机制的研究提供实验支持，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 人肝癌HepG-2细胞（武汉博士德有限公司，批号20161209）。马鞭草总黄酮（漯河医专天然药物化学教研室），以芦丁为标准品，高效液相色谱法在检测波长510 nm测得总黄酮含量约为81%，溶于适量二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，用培养基稀释成不同浓度，过滤除菌4℃保存；胎牛血清（杭州四季青生物技术公司，批号：140130）；四甲基偶氮唑盐 MTT（美国 Sigma公司，批号：M2128）；DMEM培养基（Dulbeco’s modified eagle medium，DMEM）（美国 Hyclone公司，批号：NAE1396）；TE2000型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Hep G-2细胞培养 HepG-2细胞株由漯河市医学生物工程重点实验室传代保种，用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下传代培养，0.25%的胰酶-EDTA消化。

1.2.2 Real time PCR检测 IL-6、JAK 2、STAT3 mRNA HepG-2细胞以1×105个·mL-1的密度接种于96孔培养板内，细胞贴壁后，参照前期研究设置 TFV 50、100、200 mg·L-1组，对照组给予等量培养液，设置3个复孔，培养48 h后终止培养，Trizol提取总RNA，测定其浓度。依据逆转录试剂盒说明书逆转录反应体系合成cDNA，引物序列由上海英骏公司提供。IL-6上游引物：5′-TACATCCTCGACGGCATCTC-3′，下游引物：5′-AGGACACTGTCTTTGAGCCT-3′，产物长度 359 bp。p-JAK2上游引物：5′-CTGCCGAGGGATGTGAGTG-3′，下 游 引 物：5′-CAGAACATTTGCCGGCTACAC-3′，产物长度 185 bp。p-STAT3上游引物：5′-AGGAGCATCCTGAAGC-TGAC-3′，下游引 物：5′-CGGCAGGTCAATGGTATTGC-3′，长 度 98 bp。内参 GAPDH上游引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCC-3′，下游引物：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′，产物长度262 bp。采用20μL的反应体系，其中2×SYBRR Premix Ex-TaqⅡ 10μL，上游（10 μmol）和下游（10μmol）各 0.5μL，cDNA 1μL，PCR级高纯水8μL。采用light cycleR 96实时荧光定量PCR仪进行基因扩增。采用Ct值计算基因的相对表达量（相对表达量 ＝2-△△Ct×100%，△Ct＝Ct（待测基因）-Ct（GAPDH）。

1.2.3 Western blot检测 p-JAK 2、p-STAT3 参照“1.2.2”法设置各组。细胞培养48 h后终止培养，常规方法提取蛋白质，Bradford法测定总蛋白的量。SDS-PAGE凝胶电泳，并转移至 PVDF膜，室温封闭1 h，5%山羊血清封闭，室温孵育 60 min；与一抗 p-JAK2（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、β-actin（1∶500）室温孵育1 h，4℃过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）室温孵育 1 h，行ECL反应，显色，Bio-Rad凝胶成像系统拍照，GIS凝胶成像分析软件分析，以同一泳道 p-JAK2和 p-STAT3和 β-actin条带灰度值比反映蛋白表达水平。

1.2.4 统计学处理 采用 SPSS 15.0软件，计量资料采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hep G-2细胞 IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表达与空白对照组比较，TFV 50、100、200 mg·L-1组 IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表达水平明显降低（均 P＜0.05），并呈现浓度依赖性，见图 1。

图 1 IL-6、JAK 2、STAT3 m RNA表达

2.2 JAK 2、STAT3蛋白表达水平 与空白对照组比较，TFV 50、100、200 mg·L-1组 JAK2、STAT3蛋白表达水平明显降低（均 P＜0.05），并呈现浓度依赖性，见图2-3。

图2 Western blot检测 JAK 2、STAT3蛋白表达

图3 JAK2、STAT3蛋白表达比较

3 讨论

肝癌为常见的恶性肿瘤之一，目前以手术治疗为主，辅以放疗、化疗及中医疗法［3］，但治疗后的复发和转移依然没有得到有效控制［4］。植物黄酮为高效的天然抗氧化剂，近期研究显示，植物黄酮可同时具有抗氧化和促氧化两种相反特性，尤其在诱导肿瘤细胞凋亡方面，有研究显示促氧化活性可能较抗氧化活性更加重要［5］。本组前期研究显示，马鞭草总黄酮能诱导肝癌HepG-2细胞凋亡，并存在明显的浓度依赖性［6］，而其抗肿瘤机制还不明确，与信号通路之间的关系也有待进一步研究。

JAK／STAT信号通路主要由酪氨酸激酶JAK家族和转录因子STAT家族组成，与细胞生长、增殖及分化相关［7］。JAK2为JAK家族蛋白之一，对免疫系统的稳态具有重要作用［8-9］。王恒等研究显示，采用莪术醇作用于 Jurkat细胞 24 h后，JAK2与STAT5a磷酸化蛋白水平下降［10］。姬颖华等研究显示，白藜芦醇作用于伯基特淋巴瘤细胞，能通过抑制IL-6水平，调节 JAK2／STAT3信号通路，并诱导凋亡［11］，提示JAK2在细胞增殖及恶化中的重要地位。而STAT3为JAKs下游的靶蛋白，与多种恶性肿瘤有关［12-13］，研究表明，当STAT3过度活化时，容易导致下游靶基因如 c-myc、survivin等异常表达从而诱导细胞发生癌变并阻断细胞凋亡［14-15］。研究证实，STAT3为IL-6激活的JAK2／STAT3信号通路下游的重要转录因子［16-18］。

本研究表明，马鞭草总黄酮作用Hep G-2细胞48 h后，IL-6、p-JAK2、p-STAT3 mRNA水平明显下调，下调HepG-2细胞p-JAK2、p-STAT3蛋白水平。究其原因，马鞭草总黄酮可能通过抑制JAK2磷酸化水平，进而下调 JAK2下游的 STAT3磷酸化表达，而IL-6为一种功能复杂且多效的细胞因子，IL-6异常表达可导致STAT3的过度表达，马鞭草总黄酮对IL-6的影响还有待进一步研究。研究表明，马钱子碱作用于人结肠癌SW480细胞后能通过下调STAT3蛋白进而抑制细胞增殖［19］。Shodeinde等研究表明，下调STAT3表达水平，能有效地促进细胞凋亡［20］。因此，马鞭草总黄酮诱导HepG-2细胞凋亡，抑制细胞增殖可能与JAK3／STAT5调节基因表达调节相关。

总之，马鞭草总黄酮可下调肝癌 HepG-2细胞IL-6、JAK2、STAT3水平，抑制细胞增殖。马鞭草总黄酮可能通过干预IL-6／JAK2／STAT3信号通路的活性，从而发挥较好的抗肿瘤效果，这也为马鞭草的开发和利用提供了指导。

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Effect of Total Flavonoids of Verbena officinalis on IL-6、JAK2、STAT3 level of Human Hepatocellular Carcinoma Hep G-2 Cells

LI Yong-ming1，LI Xian-jia2
（1.Department of Anorectal Diseases，People′s Hospital of Yancheng，Luohe 462300，China；2.Department of Biochemistry，Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

R966；R735.7

A

1672-688X（2017）03-0169-03

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.003

河南省高等学校青年骨干教师资助项目（2015GGJS-288）

2017-04-08

1.漯河市郾城区人民医院肛肠科，河南漯河462300

2.漯河医学高等专科学校生化教研室，河南漯河462002

李永明（1971—），男，河南漯河人，主治医师，从事肿瘤研究工作。

李先佳，男，副教授，E-mail：nzr110＠163.com