耐镉产铁载体菌株的分离及鉴定*

赵树民 虞方伯 叶正钱 方晓波 林海萍#

(1.浙江农林大学生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修复重点实验室，浙江 杭州 311300)

耐镉产铁载体菌株的分离及鉴定*

赵树民1虞方伯2叶正钱2方晓波2林海萍1#

(1.浙江农林大学生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修复重点实验室，浙江 杭州 311300)

从黑麦草(LoliumperenneL.)根际土壤中分离到1株耐镉产铁载体细菌LY02，经形态观察和16SrDNA序列测定以及同源性分析鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。该菌株能够分泌吲哚乙酸(IAA)，促进磷的溶解，有利于提高黑麦草种子发芽率和抵抗镉胁迫的能力，因此可以与黑麦草互利共生。该菌株对Cd2+的最大耐受质量浓度为10mg/L，可以促进土壤中的镉向可溶性的生物有效态转化，从而有利于黑麦草对镉的富集。

产铁载体细菌 黑麦草 镉 植物修复 巨大芽孢杆菌

Abstract: A cadmium-resistant and siderophore-producing strain was isolated from rhizospheric soil ofLoliumperenneL.. Through morphological observation and 16S rDNA sequencing determination (including homology analysis),the strain was identified asBacillusmegaterium. This strain could produce indole-3-acetic acid and accelerate phosphorus dissolved. Moreover,the strain could promote the germination rate ofLoliumperenneL. seeds and resist Cd stress. Therefore,BacillusmegateriumandLoliumperenneL. could benefit each other. The maximum tolerant Cd2+mass concentration ofBacillusmegateriumwas 10 mg/L. At the same time,theBacillusmegateriumcould transform Cd into dissolved bio-available form,easy forLoliumperenneL. to accumulate.

Keywords: siderophore-producing bacteria;LoliumperenneL.; Cd; phytoremediation;Bacillusmegaterium

植物修复因成本低、污染少、操作简单等优点而广泛应用于土壤重金属污染修复中[1]。然而用于植物修复的大部分超富集植物存在生物量小、生长缓慢、对重金属具有选择性等缺点[2]。研究表明，产铁载体细菌产生的铁载体能与重金属结合形成络合物，若产铁载体细菌与超富集植物共生，有利于提高植物对重金属的富集效率。然而，目前大部分研究的产铁载体细菌并不直接来自于超富集植物，存在共生困难等问题。

多年生黑麦草(Lolium perenneL.)是禾本科中产量较高的一种重金属超富集植物，具有环境适应性强、能耐受多种重金属、生长速度快、分蘖力强、生物量大等优点。2014年，环境保护部发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，无机污染物中镉的污染最为严重，其点位超标率为7.0%。本研究尝试从黑麦草根际土壤中筛选耐镉产铁载体细菌，对其进行分离和鉴定，以期为产铁载体细菌与超富集植物共生、提高植物对重金属的富集效率提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与培养基的配制

(1)LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl10.0g、蒸馏水1 000mL，调节pH为7.0。另加20.0g琼脂变成LB固体培养基。

(2)MSA液体培养基：蔗糖20.0g、L-天冬氨酸2.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、蒸馏水1 000mL，用0.5g8-羟基喹啉除铁，调节pH为7.0。

(3) 无机磷培养基(NBRIP)[3]:葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、KCl0.3g、Ca3(PO4)25.0g、蒸馏水1 000mL，调节pH为7.0～7.5。

(4)Salkowski’s显色剂：150mL浓硫酸溶于250mL蒸馏水中，加入7.5mL0.5mol/L的FeCl3溶液(溶剂为0.1mol/L的稀盐酸)。

(5) 铬天青S(CAS)检测液[4]：将0.079gCAS溶于50mL蒸馏水中，再加入10mL1mmol/L的FeCl3溶液(溶剂为0.1mol/L的稀盐酸)，记作溶液A。将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL蒸馏水中，记作溶液B。将溶液A沿烧杯壁缓缓加入溶液B中，搅拌混匀即得CAS检测液。

1.2 耐镉细菌的分离、纯化

在浙江农林大学平山试验基地选取长势较好的黑麦草植株，将其连根带土装入灭菌袋中带回实验室分离菌种。称取黑麦草根际土壤10g，装入三角瓶中并加入100mL无菌水，在150r/min条件下振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬浊液1mL，依次稀释102、103、104、105、106倍，然后各取100μL涂布于含2mg/LCd2+的LB固体培养基上，28 ℃倒置培养3d，挑取生长良好的单菌落纯化，-80 ℃保存。

取含有100mg/LL-色氨酸的LB液体培养基50mL分装于250mL三角瓶中，接种分离、纯化得到的耐镉细菌菌液，28 ℃、150r/min振荡培养2d。

1.3 菌株特性研究

产吲哚乙酸(IAA)检测：取5mL菌液于离心管中，6 000r/min离心10min后，取1mL上清液，加2mLSalkowski’s显色剂，充分混合，黑暗条件下显色30min， 530nm波长下测定吸光度，以未接种菌株的培养液为参比，每组做3个重复取平均值并计算IAA浓度。

溶磷能力检测：采用姜瑛等[5]的方法，将菌液接种于NBRIP中，28 ℃、150r/min条件下培养7d，6 000r/min离心10min后取上清液1mL，采用钼锑抗比色法测定上清液中溶解性磷含量。以不接种菌株的NBRIP为空白对照，重复3次取平均值。

产铁载体能力检测[6]：取50μL菌液接种到MSA液体培养基中，28 ℃、150r/min条件下培养48h，10 000r/min离心10min，取上清液3mL与3mLCAS检测液充分混匀，静置1h，在630nm波长处测定吸光度，用未接种菌株的培养液作参比，重复3次取平均值，根据文献[7]的方法计算铁载体活性(SU)，SU越大，表明菌株产铁载体能力越强。

1.4 菌株鉴定

形态观察：利用荷兰飞纳Pro扫描电子显微镜观察细菌形态。

16SrDNA序列测定与同源性分析：聚合酶链式反应(PCR)的正向引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物1513R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应在94 ℃预变性5min；94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，30个循环；72 ℃延伸10min。扩增产物测序后提交GenBank进行同源性比对，并用NJ法在Mega5软件中构建系统发育树，其中Bootstrap值设为1 000。

1.5 菌株的耐镉性测试及对土壤中镉的活化能力

取50μL菌液接种于含Cd2+质量浓度为1、2、5、10、20mg/L的LB液体培养基中，置于28 ℃、150r/min的摇床中培养3d，观察其能否生长以获得菌株的最大耐镉浓度[8]。

取50μL菌液接种于LB液体培养基中，28 ℃、150r/min培养24h，6 000r/min离心10min，取10mL上清液添加到5.0g镉污染土样中，充分混匀，重复3次，置于28 ℃下培养7d后，6 000r/min离心10min，用PerkinElmer7000DV电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)检测上清液中Cd2+含量[9]。以未接种菌液的LB液体培养基为对照。

1.6 菌株对镉胁迫下黑麦草种子萌发的影响实验

菌悬液的制备：取50μL菌液接种于100mLLB液体培养基中，28 ℃、150r/min培养48h，6 000r/min离心10min，弃上清液，再用无菌水冲洗菌体5遍，添加适量无菌水使每毫升菌液中含108cfu的细菌。再添加Cd2+使得Cd2+质量浓度分别为0、1、5、10、15mg/L。对照组以等量的无菌水代替50μL菌液。

黑麦草种子(购于临安种子站)用75%(体积分数)的酒精消毒3min，用无菌水冲洗5遍。选取饱满的种子放置于垫了两层无菌滤纸的培养皿中，每个培养皿50颗，加入上述菌悬液5mL，在温度为25 ℃，湿度为60%的恒温恒湿培养箱中培养。以长出1cm的苗长作为发芽标准，每天统计发芽数，培养7d后计算发芽率。

2 结果与讨论

2.1 菌株特性分析

在2mg/LCd2+胁迫下的LB固体培养基中共分离、纯化出3株生长良好的耐镉菌株，分别记作LY01、LY02和LY03。

由表1可见，3株菌株都能产生IAA，能够促进磷的溶解，具有产铁载体能力。IAA是植物生长过程中十分重要的生长激素，能调控植物根、茎、叶的生长和各组织的形成发育等。由微生物产生的IAA也能促进植物的生长[10]，所以有利于与超富集植物共生。磷是植物生长的必需元素，然而土壤中的磷大部分都以难溶态的形式存在，植物很难直接利用，若共生细菌能够促进磷的溶解显然有利于植物生长。3株菌株中LY02产生的IAA质量浓度最高，为26.5mg/L；其溶磷能力最强，溶解性磷质量浓度为96.3mg/L；SU最大达到86.1%，属于高产铁载体细菌。因此，后续实验选取LY02作为目标耐镉产铁载体细菌。

表1 株菌特性分析结果

2.2 菌株的鉴定结果

菌株LY02在LB固体培养基上的菌落为乳白色，近圆形，边缘规则，表面光滑，湿润，不透明。在11 000倍扫描电子显微镜下观察到的形态为杆状，产近球形芽孢(见图1)。

图1 菌株LY02在扫描电子显微镜下的形态(×11 000)Fig.1 Morphology of strain LY02 under the scanning electron microscope(×11 000)

从图2的系统发育树结果看，菌株LY02与BacillusmegateriumNBRC 15308的相似性最高，因此可以推断LY02为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，与形态分析结果也一致。

图2 菌株LY02的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain LY02

2.3 菌株的耐镉性和对土壤中镉的活化能力

耐镉性测试结果表明，耐镉产铁载体细菌巨大芽孢杆菌对Cd2+的最大耐受质量浓度为10 mg/L。

在对土壤中镉的活化能力实验中，实验组Cd2+质量浓度达到6.5 mg/kg，而对照组Cd2+质量浓度仅为4.2 mg/kg。也就是说，耐镉产铁载体细菌巨大芽孢杆菌能促进土壤中的镉向可溶性的生物有效态转化，从而有利于超富集植物对镉的富集，提高富集效率。

2.4 菌株对黑麦草种子发芽率的影响

种子发芽是植物生长的起点和关键时期，此时种子对外界环境十分敏感。其中发芽率是非常直观的指标。黑麦草种子在不同Cd2+浓度胁迫环境中的发芽率如图3所示。从图3可以看出，无论是实验组还是对照组，随着Cd2+浓度的升高黑麦草种子发芽率均下降。在相同Cd2+浓度胁迫下，实验组由于与巨大芽孢杆菌共生，黑麦草发芽率高于对照组，低浓度时这种差异不显著，但高浓度时差异显著(P<0.01)。因此，耐镉产铁载体细菌巨大芽孢杆菌与黑麦草种子共生有利于提高其发芽率和抵抗镉胁迫的能力。

注：相同字母表示在P<0.01水平上差异不显著，不同字母表示在P<0.01水平上差异显著。

图3巨大芽孢杆菌对镉胁迫下黑麦草种子发芽率的影响
Fig.3 Effects ofBacillusmegateriumon germination rate ofLoliumperenneL. seeds under Cd stress

3 结 论

从黑麦草根际土壤中分离得到耐镉产铁载体细菌LY02，经鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株能够分泌IAA，促进磷的溶解，有利于提高黑麦草种子发芽率和抵抗镉胁迫的能力，因此可以与黑麦草互利共生。该菌株对Cd2+的最大耐受质量浓度为10 mg/L，可以促进土壤中的镉向可溶性的生物有效态转化，从而有利于黑麦草对镉的富集。

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Isolationandidentificationofacadmium-resistantandsiderophores-producingstrain

ZHAOShumin1,YUFangbo2,YEZhengqian2,FANGXiaobo2,LINHaiping1.

(1.NationalJointEngineeringLaboratoryofBiopesticidePreparation,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,HangzhouZhejiang311300；2.KeyLaboratoryofSoilContaminationBioremediationofZhejiangProvince,HangzhouZhejiang311300)

赵树民，男，1992年生，硕士研究生，主要从事土壤生态修复研究。#

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*浙江省重点创新团队项目(No.2013TD12);浙江省科技厅公益技术研究农业项目(No.2015C32078)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.09.014

2016-11-10)