脂多糖诱导SPLUNC1基因的表达

肖丁良 钟礼立 高喜容

论 著

脂多糖诱导SPLUNC1基因的表达

肖丁良 钟礼立 高喜容

目的了解脂多糖（LPS）对人支气管上皮细胞（HBECs）增殖的影响，通过观察不同浓度脂多糖（LPS）不同时间诱导HBECs的短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）基因表达情况，探讨SPLUNC1在呼吸道感染中的作用。方法采用0.01、0.1、1.0、10 mg/L LPS诱导HBECs，通过噻唑蓝（MMT）法检测LPS对HBECs增殖的影响，诱导HBECs 2、4、8、16、24 h后通过实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测SPLUNC1基因表达情况，结果以SPLUNC1/GAPDH基因拷贝数比值表示。结果0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS均可抑制HBECs的生长〔吸光度（A值）：0.48±0.03、0.37±0.01、0.30±0.03、0.27±0.02，相对生长指数：94.12%、72.55%、58.82%、52.94%〕，并能诱导SPLUNC1基因表达上调；在同一浓度组，LPS刺激细胞2 h后SPLUNC1基因表达开始上调，随着时间延长逐渐升高，呈时间依赖性〔0.01 mg/L组2、4、8、16、24 h分别为0.19±0.03、0.24±0.04、0.26±0.03、0.44±0.05、0.51±0.07；0.1 mg/L组分别为0.43±0.02、0.52±0.05、0.60±0.06、0.63±0.08、0.68±0.05；1.0 mg/L组分别为0.44±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.58±0.05、0.70±0.06；10 mg/L组分别为0.34±0.03、0.38±0.04、0.68±0.05、0.96±0.08、0.98±0.07〕，不同时间点组间比较差异有统计学意义（均P＜0.01）。结论LPS可抑制HBECs的生长，能诱导HBEC细胞SPLUNC1基因表达上调，并在一定浓度范围内表达呈时间依赖性，推测SPLUNC1可能参与细菌感染最初的防御。

脂多糖； 人支气管上皮细胞； 短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1

革兰阴性（G-）菌是儿童呼吸道感染常见病原菌［1］；也是医院感染主要病原菌［2］。G-菌对抗菌药物耐药性逐年增加，除合理选择抗菌药物降低耐药性外，还应研发新型抗菌药物、寻找其他抗菌物质。

黏膜分泌蛋白人上腭、肺及鼻咽上皮癌相关蛋白（PLUNC）家族是呼吸道的先天免疫防御物质，在保护呼吸道正常的生理功能中起重要作用，而短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）是其家族中高表达于呼吸道并参与先天免疫应答的蛋白分子。目前对SPLUNC1作用机制和功能的研究还没有一致的定论，但大多认为它参与了呼吸道抵御病原菌的先天免疫应答，且很有可能拥有抑菌、杀菌的作用，可能成为将来抗菌药物耐药压力下的另一种抗菌物质选择方案。

SPLUNC1是高表达于呼吸道上皮并参与固有免疫的蛋白分子。鉴于SPLUNC1表达的组织特异性，且能结合G-菌脂多糖（LPS），并具有杀灭细菌的作用。且实时荧光聚合酶链反应（FQ-PCR）技术简便、快捷、灵敏度高、特异性强，在临床上应用广泛，具有较高的应用价值［3-4］。故本研究选择G-菌死亡后释放的毒力产物LPS，通过FQ-PCR方法检测不同浓度LPS诱导人支气管上皮细胞（HBECs）不同时间SPLUNC1表达的变化，为以后人工调控其分泌、防治呼吸道感染进行前期研究，为防治儿童呼吸道感染提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 LPS购于美国Sigma公司；HBECs购于湘雅医学院细胞中心；总RNA提取试剂盒（E.Z.N.A.Total RNA Kit I）购于美国Omega公司；RPMI-1640购于美国Gibco公司；反转录试剂盒（Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time）购于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 HBECs的培养 用10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基在5% CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养HBECs。

1.2.2 实验分组及细胞增殖检测 通过噻唑蓝（MTT）法检测LPS对细胞增殖的影响。将生长良好的HBECs置于5% CO2培养箱中培养24 h后弃原培养液，分为对照组和不同浓度LPS组（浓度分别设为0.01、0.1、1.0、10 mg/L），各浓度设4个复孔。在培养终止前每孔加入20 μL MTT溶液再继续培养4 h，然后弃去上清液，加入150 μL二甲基亚砜，放到摇床上待结晶完全溶解，通过酶标仪570 nm测定吸光度值（A值）。相对生长指数（GI）＝（处理组A值/对照组A值）×100%，GI＞100%为刺激生长，GI＜100%为抑制生长。

1.2.3 FQ-PCR测定SPLUNC1基因表达

1.2.3.1 分组及处理方法 将HBECs分为LPS组和对照组。LPS组分别加入浓度为0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS，细胞培养箱中培养2、4、8、16、24 h，再提取细胞总RNA用于FQ-PCR检测，以上同样实验重复3次。

1.2.3.2 细胞总RNA提取及cDNA的合成 严格按照试剂盒操作说明提取RNA；电泳检测RNA的质量，并计算RNA含量，-20 ℃保存备用。

1.2.3.3 引物、探针由上海生工生物工程有限公司设计和合成。

1.2.3.4 制备标准品 将反转录所得的cDNA进行半定量PCR，由上海生工生物工程有限公司将PCR产物及扩增引物构建SPLUNC1、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因质粒，提取RNA测A值，并得出基因拷贝数及其相应的浓度，得到质粒的实时荧光定量标准品。

1.2.3.5 FQ-PCR反应 将反转录所得的cDNA模板稀释10倍，将模板、引物与Mix混合，PCR反应体系和程序分别见表1，获得SPLUNC1 mRNA及GAPDH mRNA的拷贝数。

表1 FQ-PCR反应体系及反应程序

1.3 统计分析 本检测测数据均采用SPSS 13.0软件软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差表示，采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测不同浓度LPS刺激对HBECs增殖的影响 LPS在一定浓度范围内（0.01～10 mg/L）能抑制细胞生长，存在剂量依赖性，细胞活力明显降低。见表2。

表2 不同浓度LPS对HBECs细胞增殖的影响

表3 不同浓度LPS对HBECs细胞SPLUNC1基因相对表达量的影响

表3 不同浓度LPS对HBECs细胞SPLUNC1基因相对表达量的影响

注：与对照组比较，；与前一浓度比较；与前一时间点比较

2.2 FQ-PCR检测SPLUNC1基因表达

2.2.1 FQ-PCR对不同时间点上SPLUNC1基因的表达情况检测结果结合标准曲线，我们可得到样品中SPLUNC1基因拷贝数（见图1）及看家基因GAPDH基因拷贝数（见图2），其中横坐标代表Ct值，纵坐标代表荧光强度。

图1 SPLUNC1基因绝对定量结果扩增曲线

图2 GAPDH基因绝对定量结果扩增曲线

2.2.2 通过SPLUNC1/GAPDH基因拷贝数比值得到LPS诱导的SPLUNC1相对表达量，见表3。LPS诱导细胞2 h后SPLUNC1基因表达开始上调，同一浓度组随时间延长（2、4、8、16、24 h）基因表达量持续增高，在一定时间范围内呈时间依赖性。不同时间组间比较差异有统计学意义（均P＜0.01）。

3 讨论

SPLUNC1蛋白可调节免疫应答和炎症反应，抑制病原菌的繁殖及呼吸道感染的发展，其作用机制目前不是很清楚。SPLUNC1蛋白可通过增加细菌细胞壁的渗透性、诱导中性粒细胞的趋化、抑制生物膜的形成达到杀菌或抑菌的作用。Sayeed等［5］研究发现，体内外环境中的SPLUNC1均有抑制铜绿假单胞菌生长的功能；Liu等［6］发现，SPLUNC1蛋白能让小鼠抵抗肺炎克雷伯菌的能力增强。另外，肺炎链球菌感染［7］、肺炎支原体感染［8］也可以诱导SPLUNC1表达，从而发挥宿主防御作用。

本实验发现，与对照组比较，LPS可抑制HBECs的生长，并能诱导SPLUNC1基因表达上调。在刺激2 h后发现基因表达开始上调，并在24 h内随着时间的延长持续增高，呈时间依赖性。推测可能随着时间的延长，细菌感染加重，SPLUNC1蛋白的增加，机体抵抗细菌的能力也增强。在细菌及肺炎支原体感染后均可诱导支气管上皮细胞SPLUNC1基因表达，但在两者感染后基因表达量是否存在差异还有待进一步研究。

综上所述，SPLUNC1蛋白能抵抗外界病原微生物的入侵，还能作为防御蛋白来保护宿主；同时可以增强慢性肺部疾病患者呼吸道对外界病毒、细菌的防御。这为以后SPLUNC1蛋白作为临床药物开发打下良好的基础。

1 张瑾.住院儿童下呼吸道感染病原监测及耐药谱分析［D］.石家庄：河北医科大学，2014.

2 邱卫强.我院2011—2013年细菌的菌群分布特点与耐药性分析［J］.实用检验医师杂志，2014，6（1）：21-26.

3 黄铭珊，金霆.探讨实时荧光定量PCR法检测血液新生隐球菌的临床意义［J］.实用检验医师杂志，2015，7（1）：28-31.

4 林瀛，陈小岩，俞训彬.结核分枝杆菌DNA实时定量PCR技术在临床病理诊断中的应用［J］.实用检验医师杂志，2015，7（3）：143-147.

5 Sayeed S，Nistico L，St Croix C，et al. Multifunctional role of human SPLUNC1 in Pseudomonas aeruginosa infection ［J］. Infect Immun，2013，81（1）：285-291.

6 Liu Y，Bartlett JA，Di ME，et al. SPLUNC1/BPIFA1 contributes to pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae respiratory infection ［J］. Am J Pathol， 2013，182（5）：1519-1531.

7 尚燕萍，林立，李昌崇.肺炎链球菌诱导SPLUNC1表达及白藜芦醇对SPLUNC1表达的影响［J］.中国当代儿科杂志，2017，19（1）：111-116.

8 肖丁良，钟礼立，梁沫，等.肺炎支原体脂质膜蛋白诱导人支气管上皮细胞SPLUNC1的表达［J］.医学临床研究，2013，30（6）：1041-1045.

SPLUNC1 gene expression induced by lipopolysaccharide

Xiao Dingliang, Zhong Lili, Gao Xirong.
Children's hospital neonatal of Hunan Province, People's Hospital Pediatrics of Hunan Province, Changsha 410007, Hunan, China

ObjectiveTo study the effects of lipopolysaccharide (LPS) on the growth of human bronchial epithelial cells (HBECs). To observe the expression of short palate lung and nasal epithelium clone 1 (SPLUNC1)at different time points after being induced by LPS of different concentration in HBECs. To explore the role of SPLUNC1 in respiratory tract infection.MethodsThe expression of SPLUNC1 gene in HBECs at different time points (2, 4, 8, 16, 24 hours after LPS simulated) induced by different concentrations of LPS (0.01, 0.1, 1.0,10 mg/L) was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), and the growth of HBECs was detected. SPLUNC1 gene level results were demonstrated by SPLUNC1/GAPDH gene copies ratio.ResultsLPS inhibited the growth of HBECs [absorbance （A） value: 0.48±0.03, 0.37±0.01, 0.30±0.03,0.27±0.02, relative growth index: 94.12%, 72.55%, 58.82%, 52.94%], and induced the expression of SPLUNC1 gene; in the same concentration group, SPLUNC1 gene expression began to increase after 2 hours stimulation of LPS, with the prolongation of time gradually increased in a time dependent manner (0.01 mg/L group on 2、4、8、16、24 hours were 0.19±0.03, 0.24±0.04, 0.26±0.03, 0.44±0.05, 0.51±0.07, respectively; 0.1 mg/L group were 0.43±0.02, 0.52±0.05, 0.60±0.06, 0.63±0.08, 0.68±0.05, respectively; 1.0 mg/L group were 0.44±0.02,0.48±0.02, 0.50±0.03, 0.58±0.05, 0.70±0.06, respectively; 10 mg/L group 0.34±0.03, 0.38±0.04, 0.68±0.05,0.96±0.08, 0.98±0.07, respectively). There was statistical significance difference between the two groups at different time points (all P ＜ 0.01).ConclusionsLPS can reduce the growth of HBECs induced by LPS, increase the expression of SPLUNC1 gene, and its expression is time-dependent in a certain range. It is speculated that SPLUNC1 may be involved in the initial defense of bacterial infection.

Lipopolysaccharide; Human bronchial epithelial cells; Short palate lung and nasal epithelium clone 1

2017-05-17）

（本文编辑：杨程伍 李银平）

410007 湖南长沙，湖南省儿童医院新生儿科（肖丁良，高喜容）；湖南长沙，湖南省人民医院儿科（钟礼立）

肖丁良，Email：xjsd8902@126.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.03.013

Corresponding author: Xiao Dingliang, Email: xjsd8902@126.com