宫颈鳞癌患者宫颈液基脱落细胞中P16、P53蛋白及HPVE6/E7 mRNA的表达

童婷婷,马 杰,董丽杰,王 莉#

1)郑州大学附属肿瘤医院妇瘤科 郑州 450000 2)郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州 450000

宫颈鳞癌患者宫颈液基脱落细胞中P16、P53蛋白及HPVE6/E7mRNA的表达

童婷婷1),马 杰2),董丽杰1),王 莉1)#

1)郑州大学附属肿瘤医院妇瘤科 郑州 450000 2)郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州 450000

宫颈鳞癌；P16；P53；HPV E6/E7mRNA；宫颈液基细胞学

目的：探讨宫颈液基脱落细胞中P16、P53蛋白及HPV E6/E7 mRNA的表达情况。方法采用支链DNA技术及细胞涂片免疫组化的方法检测182例宫颈鳞癌患者宫颈液基脱落细胞中P16、P53蛋白及HPV E6/E7 mRNA的表达水平。结果宫颈液基脱落细胞中P16表达与淋巴结转移、病理分级有关(P<0.05)，P53表达与淋巴结转移、临床分期、病理分级有关(P<0.05)，HPV E6/E7 mRNA表达与患者临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)；HPV E6/E7 mRNA与P16蛋白表达呈正关联(rP=0.444，P<0.001)，与P53蛋白表达不具有关联性(P=0.125)；P53蛋白与P16蛋白表达呈正关联(rP=0.505，P<0.001)。结论宫颈液基脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA、P16、P53检测可能对宫颈癌预后评估有重要价值。

宫颈癌是威胁妇女健康的常见恶性肿瘤之一，据统计有超过85%的病例发生在发展中国家。在我国宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤的第二位，死亡率却居于首位[1-2]。因此评估影响宫颈癌预后的相关因素尤为重要。结合临床可知影响宫颈癌预后的临床病理因素有很多，如年龄、临床分期、病理类型、病理分级、肿瘤大小、淋巴结转移情况等。宫颈癌的发生发展与许多生物学标志物密切相关，其中HPV E6/E7蛋白为宫颈上皮细胞内瘤变或癌变发生发展的主要转化蛋白[3]，P16和P53蛋白也在宫颈癌发生发展进程中起着至关重要的作用。该研究拟在宫颈鳞癌患者宫颈脱落细胞中采用支链DNA技术检测HPV E6/E7 mRNA，采用细胞涂片免疫组化方法检测P16、P53蛋白的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料回顾性分析郑州大学附属肿瘤医院妇科2014年1月至2016年1月间182例宫颈癌患者的临床病理资料。患者28～80岁，中位年龄50岁；均经病理学确诊为鳞癌，排除腺癌、神经内分泌等其他组织学类型；其中Ⅰ期91例，ⅡA期29例，ⅡB期41例，Ⅲ期18例，Ⅳ期3例；术前均未接受过放化疗；术后病理或放疗前影像学示盆腔淋巴结转移者82例，无淋巴结转移者100例；病理分级为G1 40例，G2 88例，G3 54例。

1.2宫颈液基薄层细胞学取样窥阴器充分暴露宫颈，用棉拭子将宫颈过多的分泌物擦去，将宫颈刷置于宫颈口鳞柱交界区，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3～5圈，停留10秒以上，取出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的样本管中。在管口处将多余的刷柄折断，将刷头留在样本管中，旋紧管盖，填写基本信息并保持样本管直立放置，送检。一部分用于HPV E6/E7 mRNA检测，另一部分制成细胞涂片检测P16和P53蛋白的表达水平。

1.3P16、P53蛋白的检测取宫颈液基薄层细胞学标本5 mL制成细胞涂片，于体积分数85%乙醇中固定15 min，10 g/L吐温稀释液细胞打孔5 min，以体积分数3%双氧水洗涤3 min以去除过氧化物酶，PBS冲洗3次后加入一抗P16、P53鼠抗人单克隆抗体(上海基因科技有限公司)，37 ℃孵育1 h，PBS缓冲液冲洗3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB(上海基因科技有限公司)显色，显微镜(BX51，Olympus)下观察，苏木精染色，梯度乙醇脱水，封片。P16阳性细胞表现为胞核或胞浆棕黄色着色，P53阳性细胞表现为胞核棕黄色着色。每例制备2张切片，每张切片选择10个高倍视野，共计数100个细胞，计算阳性细胞百分率；由两名经验丰富的病理科医师同时读片，取其平均值。评判标准参见文献[4]。P53：无阳性细胞为阴性表达，有阳性细胞为阳性表达。P16：阳性细胞百分率<10%为阴性表达，≥10%为阳性表达。

1.4HPVE6/E7mRNA的检测采用支链DNA技术检测。具体操作步骤：裂解细胞以释放总RNA，杂交捕获目的RNA后分别与预放大分子、放大分子结合，杂交结合标记有碱性磷酸酶的支链DNA探针，添加底物与标记探针上的碱性磷酸酶结合生成化学发光信号，在冷光仪(QuantiVirusTM，新乡科蒂亚生物技术有限公司)上进行检测，读取实验结果。检测结果值≥1.0为阳性。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0进行数据处理。不同临床病理特征患者3个指标阳性表达率的比较采用χ2检验，3个指标表达的关联性应用列联系数评估，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同临床病理特征宫颈鳞癌患者宫颈脱落细胞中P16、P53蛋白和HPVE6/E7mRNA的表达

见图1、表1。宫颈脱落细胞中P16阳性表达率为66.5%(121/182)，其表达与淋巴结转移、病理分级有关(P<0.05)；P53阳性表达率为65.4%(119/182)，其表达与临床分期、淋巴结转移、病理分级有关(P<0.05)；HPV E6/E7 mRNA阳性表达率为89.0%(162/182)，其表达与患者临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。

2.2宫颈鳞癌患者宫颈脱落细胞中P16、P53蛋白及HPVE6/E7mRNA表达之间的关系HPV E6/E7 mRNA与P16表达呈正关联,与P53表达无关联性，见表2。P53与P16蛋白表达呈正关联，见表3。

图1 P53(A)、P16(B)蛋白的表达(SP,×400)

*：校正χ2检验。

表2 宫颈鳞癌患者宫颈脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA与P16、P53表达的关系 例

*：rp=0.444，P<0.001；#：rp=0.113，P=0.125。

表3 宫颈脱落细胞中P16与P53表达的关系 例

rp=0.505，P<0.001。

3 讨论

HPV基因的E区有6个开放性阅读框架，其中E6、E7基因对宫颈癌的发生发展意义重大，其编码蛋白是使宫颈正常细胞发生恶变的主要转化蛋白。P53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。野生型P53蛋白半衰期短、含量低，普通免疫组化法检测到的P53蛋白多为其突变体。p16是一种抑癌基因。研究[3]发现HPV E6可与P53相互作用，使P53蛋白降解而失去抑癌作用，使得宿主细胞发生恶变的机会增加。HPV E7则作用于Rb，使其失去活性，失活后的Rb基因可反向激活多种转录因子，其中与DNA顺式作用元件的结合可激活p16基因转录，造成P16蛋白的高度活化[3]，使得P16和Ki-67表达水平上升，进而引起细胞周期紊乱，导致细胞恶变。E6蛋白还可促进端粒逆转录酶活性，稳定和修复染色体端粒末端的重复DNA序列，从而引起细胞无限制增殖[5]。

目前国内外对P16、P53蛋白的检测大多采用组织蜡块免疫组化法，此方法需要进行宫颈活检、锥切或手术切除以获取标本，给患者造成了不同程度的损伤。采用细胞涂片免疫组化法，只需取患者的宫颈液基脱落细胞即可进行检测，标本的获取比较方便且无创。该研究利用支链DNA技术检测了宫颈鳞癌患者宫颈液基脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA的表达，采用细胞涂片免疫组化法检测P16、P53蛋白的表达。结果显示：临床分期晚、有淋巴结转移的患者宫颈液基脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA阳性率较高；病理学分级差(分化程度低)，有淋巴结转移的患者P16蛋白阳性表达率较高，与Lin等[6]、朱凤琴等[7]、Queiroz等[8]的研究结果相似；临床分期晚、病理学分级差、有淋巴结转移的患者P53蛋白阳性表达率较高，与Liu及陈晓露等[9-10]的研究结果相似。但是楼朝霞等[11]发现宫颈癌组织中P53及P16的表达与临床分期及病理分级有关，与年龄、淋巴结转移无关。研究之间存在的这些差异值得进一步的探讨，但结果还是提示宫颈液基脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA、P16、P53蛋白的表达与宫颈鳞癌预后的相关临床病理因素之间有着密切联系。

该研究还发现，宫颈鳞癌患者宫颈液基脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA与P16蛋白表达呈正关联，P53与P16蛋白的表达呈正关联。提示宫颈液基脱落细胞中P16的表达与HPV感染关系密切，与Chew等[12]、傅小一等[13]的研究结果一致；P53与P16蛋白的联合检测可能对预后的评估更有意义。该研究未发现HPV E6/E7 mRNA与P53蛋白表达之间存在关联。有学者[14]研究发现p53及E6基因都存在许多变体，二者不同变体之间的相互作用不尽相同，从而导致它们对宫颈癌的作用存在个体差异。这些变体的分布可能与地域因素有关。R8Q和R10Q的变化可以减弱E6对P53的降解能力，但是其他变体的作用目前还不明确。

综上所述，宫颈液基脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA及P16、P53蛋白的表达与宫颈鳞癌关系密切，可在非创伤情况下检测，可能对宫颈癌患者预后的评估和指导临床治疗意义重大。

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(2016-11-01收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of P16, P53 proteins and HPV E6/E7 mRNA in cervical liquid-based cells from cervical squanmous cell carcinoma patients

TONGTingting1)，MAJie2)，DONGLijie1)，WANGLi1)1)DepartmentofFemaleTumor,theAffiliatedTumorHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000

2)DepartmentofMolecularPathology,theAffiliatedTumorHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000

cervical squamous cell carcinoma;P16;P53;HPV E6/E7 mRNA;cervical liquid-based cytology

Aim: To investigate the value of detection of P16, P53 proteins and HPV E6/E7 mRNA in liquid-based cells of cervical squanmous cell carcinoma patients. Methods: The expressions of HPV E6/E7 mRNA, P16 and P53 proteins were detected by branch-DNA and immunohistochemical method in liquid-based cells from 182 patients with cervical squamous cell carcionma. Results: The expression of HPV E6/E7 mRNA in liquid-based cells was related with lymph node metastasis and clinical stage(P<0.05),the expression of P16 was related with lymph node metastasis and histology classification(P<0.05),and that of P53 was related with lymph node metastasis,clinical stage and histology classification(P<0.05). HPV E6/E7 mRNA in liquid-based cells was positively associated with the expression of P16(rP=0.444,P<0.001),but not with P53(P=0.125). The expression of P53 protein was positively associated with that of P16(rP=0.505,P<0.001). Conclusion: HPV E6/E7 mRNA,P16 and P53 protein detection in liquid-based cells may be valueable for predicting the prognosis of cervical cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.030

R737.33

，女，1964年8月生，学士，主任医师，研究方向：妇科肿瘤的基础与临床，E-mail：2082772078@qq.com