肝内胆管癌组织中GRP78和IL-6的表达*

唐文超，翟文龙，叶健文，王 刚，李志远，陈向东

郑州大学第一附属医院肝胆胰外科 郑州 450052

肝内胆管癌组织中GRP78和IL-6的表达*

唐文超，翟文龙#，叶健文，王 刚，李志远，陈向东

郑州大学第一附属医院肝胆胰外科 郑州 450052

GRP78；IL-6；肝内胆管结石；肝内胆管癌

目的：探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和白细胞介素-6(IL-6)在肝内胆管癌组织中的表达。方法采用免疫组化法检测GRP78和IL-6在48例肝内胆管癌，48例肝内胆管结石及30例正常肝内胆管组织中的表达。结果GRP78和IL-6在肝内胆管癌组织中的阳性表达率分别为64.6%和60.4%，在肝内胆管结石胆管组织中的阳性表达率分别为75.0%和68.8%，均高于正常肝内胆管组织(6.7%和13.3%)(P<0.05)。肝内胆管癌组织中GRP78和IL-6的表达呈正关联(rP=0.280，P=0.044)。GRP78阳性表达与癌组织的分化程度(P=0.035)、淋巴结转移(P=0.015)、TNM分期(P<0.01)有关；GRP78阳性表达与阴性表达患者相比，生存曲线左移(P<0.05)，中位生存时间较短。IL-6阳性表达与癌组织的淋巴结转移(P=0.008)及TNM分期(P=0.015)有关；IL-6阳性表达与阴性表达患者比较，生存曲线差异无统计学意义(P=0.331)。结论GRP78和IL-6可能参与了肝内胆管组织的恶变过程，并与胆管癌的生长、转移关系密切。

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是一种源于二级及以上肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，而肝内胆管结石能够诱发ICC，其具体机制尚不清楚，多数认为结石的机械性刺激和胆汁淤积引起的胆管慢性炎症导致了ICC的发生[1]。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)是内质网应激诱导表达的关键蛋白，而内质网应激反应同炎症和肿瘤的发生密切相关[2]。白细胞介素-6(IL-6)作为一种重要的炎症反应因子，参与了肿瘤的发生，并同肿瘤的生物学行为存在密切联系[3]。该研究采用免疫组化法检测ICC和肝内胆管结石胆管组织中GRP78和IL-6的表达，探讨它们与ICC患者临床病理特征和预后的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象回顾性收集郑州大学第一附属医院肝胆胰外科2012年1月至2014年12月行肝部分切除手术且临床病历资料完整患者的组织蜡块。① ICC组织48例，患者男26例，女22例，年龄28～74岁；均经影像学及术后病理确诊，术前均未接受放疗、化疗及生物治疗；剔除向肝内生长的肝门部胆管癌患者、具有5 a内其他肿瘤病史者、混合型肝癌者、重症化脓性胆管炎合并肝功能衰竭者。②肝内胆管结石胆管组织48例，患者男13例，女35例，年龄30～75岁；均经影像学及术中确诊，术后病理证实未合并癌变；排除其他肿瘤病史。③正常胆管组织30例，取自单纯肝血管瘤切除组织，患者男3例，女27例，年龄28～69岁；均经影像学及术中确诊，术后病理证实未合并其他肝脏疾病。

1.2胆管组织中GRP78和IL-6的检测标本以甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用免疫组化法检测GRP78和IL-6。PV-9000二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人GRP78抗体(稀释度1400)、兔抗人IL-6抗体(稀释度1400)购自美国CST公司，按试剂盒说明书操作。组织切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇和蒸馏水水化，枸橼酸盐缓冲液高火2 min低火15 min微波抗原修复，体积分数3%过氧化氢去离子水阻断内源性过氧化物酶10 min，加一抗4 ℃孵育过夜，加通用型二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，封片，镜检采集数据。用PBS代替一抗作为阴性对照。由2名对患者临床资料不知情的病理科医生同时阅片，结果有分歧时由第三人阅片，共同讨论，判定结果。应用普通光学显微镜阅片，阳性细胞表现为胞质黄色或棕黄色着色。在高倍镜(×400)下观察10个视野，观察阳性细胞染色程度并计算阳性细胞百分比。细胞无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色着色分别计为0、1、2、3分；阳性细胞百分比<5%、5%～、26%～、51%～、>75%分别计为0、1、2、3、4分。两项评分相加，<2分判为阴性，≥2分判为阳性。

1.3统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学处理。不同胆管组织、不同临床病理特征的ICC组织中GRP78和IL-6阳性表达率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；ICC组织中GRP78和IL-6表达的关联性采用列联系数评估；采用Kaplan-Meier法分别绘制GRP78、IL-6阴性和阳性患者的生存曲线，并进行Log-rank检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3种胆管组织中GRP78和IL-6表达的比较

GRP78、IL-6主要定位于细胞质内(图1)。肝内胆管结石组和ICC组GRP78、IL-6的阳性表达率差异无统计学意义，但均大于正常胆管组，见表1。

2.2不同临床病理特征患者ICC组织中GRP78和IL-6表达的比较见表2。分化程度低、有淋巴结转移、TNM分期高的患者ICC组织中GRP78阳性表达率较高，有淋巴结转移、TNM分期较高者IL-6阳性表达率较高(P<0.05)。

*与正常胆管组比较，P<0.01。

表2 不同临床病理特征患者ICC组织中GRP78和IL-6表达的比较

续表2

*:精确概率。

2.3ICC组织中GRP78和IL-6表达的关联性见表3。在48例ICC组织中，GRP78和IL-6的表达呈正关联。

表3 ICC组织中GRP78和IL-6表达的关联性 例

rP=0.280，P=0.044。

2.4GRP78和IL-6表达与ICC患者预后的关系

对48例ICC患者采用电话方式进行随访，随访时间自患者接受手术之日起至2016年6月1日或患者死亡或失访日期(失访7例)。生存曲线见图2、3，分析结果显示，GRP78阳性表达与阴性表达患者生存曲线差异具有统计学意义(χ2=3.999,P=0.046)；IL-6阳性表达与阴性表达患者生存曲线差异无统计学意义(χ2=0.944,P=0.331)。

图2 GRP78阳性和阴性表达患者的生存曲线

图3 IL-6阳性和阴性表达患者的生存曲线

3 讨论

研究[4-5]表明，在葡萄糖缺乏、酸中毒、缺氧、钙离子平衡失调、病毒和细菌感染等刺激下，细胞中的蛋白质无法折叠或错误折叠并堆积于内质网内，可引起内质网应激并启动未折叠蛋白反应，从而诱发一系列病理生理改变。GRP78又称为免疫球蛋白重链结合蛋白,属于热休克蛋白70(heat shock protein70, HSP70)家族的一员，主要分布于内质网中，是内质网应激反应的关键蛋白[6]。它通过阻止内质网的新生肽聚集及参与调控未折叠蛋白反应，启动内质网应激相关性细胞凋亡及钙离子稳态的调节，发挥其生物功能[7]。许多实体肿瘤产生于局部炎症刺激，炎症细胞可以诱发正常基因的不稳定性，进而导致一系列病理生理学改变，最终诱发恶性肿瘤[8]。GRP78可以通过PERK、IRE1和ATF-6信号通路促进核转录因子NF-κB的表达，促进包括IL-6在内的多种细胞因子的释放[9-10]。IL-6可以通过结合受体IL-6Rα和共同受体gp130激活JAK/STAT信号通路，从而诱发肿瘤[11-12]。已有研究[13-14]证实，GRP78在肺癌、肝癌、胃癌等多种实体肿瘤组织中存在高表达现象，并同肿瘤的恶性程度、转移情况及预后密切相关。有证据[15]显示，在胆管癌患者的血清和肿瘤细胞中IL-6表达上调，肿瘤的生长、转移与IL-6存在密切联系。另外IL-6还可以诱发血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤血管的生成[16]。肺癌、卵巢癌等患者血清IL-6水平与肿瘤的进展及预后相关，并在化疗或手术后随之降低，提示IL-6可以作为肿瘤的治疗靶点之一[17]。

该研究结果显示，ICC和肝内胆管结石胆管组织中GRP78和IL-6的表达均高于正常胆管组织；有淋巴结转移、低分化、TNM晚期的ICC患者癌组织中GRP78阳性表达率较高，GRP78阳性表达的患者术后生存时间短于阴性表达者；TNM晚期和有淋巴结转移的ICC患者癌组织中IL-6的表达升高，但未发现其表达与术后预后有关。ICC组织中GRP78和IL-6的表达具有关联性，提示二者可能参与了ICC的发生发展。研究[18-20]发现，通过基因敲除的方法抑制GRP78的表达，不仅能有效抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，也提高了肿瘤细胞的化疗敏感性，提示GRP78未来可以成为治疗肿瘤的靶点。

总之，GRP78和IL-6在ICC组织中的表达升高， 两者可能参与了肝内胆管结石诱导胆管组织癌变的过程，并与肿瘤的生长、转移密切相关。GRP78和IL-6有可能成为ICC治疗的靶点。

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(2016-11-15收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of GRP78 and IL-6 in intrahepatic cholangiocarcinoma tissue

TANGWenchao,ZHAIWenlong,YEJianwen,WANGGang,LIZhiyuan,CHENXiangdong

DepartmentofHepatobiliaryopancreatSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

GRP78;IL-6;hepatolithiasis;intrahepatic cholangiocarcinoma

Aim: To explore the expressions of GRP78 and IL-6 in intrahepatic cholangiocarinoma(ICC) tissue.Methods: The expressions of GRP78 and IL-6 were detected by immunohistochemical technique in 48 cases of ICC, 48 cases of hepatolithiasis and 30 cases of normal intrahepatic bile duct tissue.Results: The positive rates of GRP78 and IL-6 in ICC tissue were 64.6% and 60.4%, in hepatolithiasis tissue were 75.0% and 68.8%, respectively, which were significantly higher than those in normal intrahepatic bile duct tissue(6.7% and 13.3%,P<0.05). The expression of GRP78 was positively correlated with that of IL-6 (rP=0.280，P=0.044) in ICC tissue. The expression of GRP78 was related with tumor histologic grade(P=0.035), lymph node metastasis(P=0.015) and TNM stage(P<0.01). The patients with positive expression of GRP78 had shorter survival time than those with negative expression(P<0.05). The expression of IL-6 was associated with lymph node metastasis(P=0.008) and TNM stage(P=0.015).There was no significant difference in survival curves of the patients with positive expression of IL-6 and those with negative expression(P=0.331).Conclusion: GRP78 and IL-6 may participate in the progress, growth and metastasis of ICC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.023

R735.8

#通信作者，男，1976年10月生，博士，副教授，副主任医师，研究方向：肝胆胰外科疾病的基础与临床，E-mail：zhaiwenlong@sina.com

*河南省高校科技创新人才支持计划 14HASTIT030