缺氧下膀胱癌细胞黏附能力和侵袭能力的变化*

樊长晖，许长宝， 郝 斌，吴国清，赵兴华

郑州大学第二附属医院泌尿外科 郑州 450014

缺氧下膀胱癌细胞黏附能力和侵袭能力的变化*

樊长晖，许长宝， 郝 斌，吴国清，赵兴华#

郑州大学第二附属医院泌尿外科 郑州 450014

膀胱癌；缺氧；黏附；迁移

目的：探讨缺氧条件下不同分化膀胱癌细胞5637和T24生物学特性变化。方法将不同分化程度的膀胱癌细胞5637和T24分别置于正常氧浓度条件下(37 ℃, 体积分数5% CO2和体积分数21% O2)和缺氧(37 ℃、体积分数10%O2、体积分数5% CO2和体积分数85%N2)环境中培养，以MTT法和Boyden侵袭小室法检测两种膀胱癌细胞在不同环境下黏附能力和侵袭能力的差异。结果随着培养时间的延长，缺氧组和对照组5637和T24细胞的黏附率逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.001)；5637和T24细胞黏附率在缺氧24 h与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但缺氧48 h和72 h两种细胞的黏附能力均高于对照组(P<0.05)；缺氧组5637和T24细胞的穿膜细胞数均高于对照组(P<0.001)。结论缺氧条件下膀胱癌细胞的黏附和迁移能力增强。

膀胱癌(bladder cell carcinoma，BCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤。较高的发病率、复发率以及较差的自然病程预后是临床诊断和治疗中经常遇到的难题。近期有研究[1]表明，缺氧在恶性肿瘤的侵袭转移过程中起着重要的作用。作者在体外模拟缺氧环境，观察膀胱癌细胞在缺氧条件下黏附和迁移能力的变化。

1 材料与方法

1.1主要材料人中分化移行细胞癌细胞系5637、低分化移行细胞癌细胞系T24(购自中国科学院上海细胞研究所)，人工基膜Matrigel胶(购自北京大学医学部细胞生物学实验室)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，购自美国Sigma公司)，Boyden Chamber小室(购自江苏海门麒麟医用仪器厂)，RPMI 1640细胞培养基(购自Gibco公司)，胎牛血清(FBS，购自美国Hyclone公司)。

1.2膀胱癌细胞5637和T24细胞黏附能力的MTT法检测取两组对数生长期的膀胱癌细胞5637和T24，调整细胞浓度为1×105mL-1的细胞悬液，取96孔培养板，每孔加用RPMI 1640稀释Matrigel胶10 μL，凝固成胶后紫外线消毒灭菌，取0.2 mL单细胞悬液加入制成的96孔培养板内，常规培养，每种细胞均在正常氧浓度(37 ℃, 体积分数5% CO2和体积分数21% O2)和缺氧(37 ℃、体积分数10% O2、体积分数5% CO2和体积分数85%N2)环境中培养(培养24、48和72 h)，每组均设6个平行孔。吸出各组细胞培养液及悬浮细胞，加入无血清RPMI 1640 0.2 mL继续培养120 min，加入20 μL MTT培养4 h，加DMSO 200 μL，用自动酶标读数仪测定每孔吸光度(A)值。按MTT比色法测定各孔细胞的A值，以对照组基底膜组贴壁细胞A值为参照。按公式计算细胞黏附率。黏附率(%)=[实验组细胞A值/对照组细胞A值-1] ×100%。

1.3膀胱癌细胞5637和T24侵袭能力的Boyden小室法检测取缺氧条件下培养48 h的膀胱癌细胞5637和T24备用。Boyden小室的下室趋化因子为200 μL/室人成纤维细胞无血清条件培养基。上下室之间用直径为13 mm、微孔为8 μm的聚碳酸酯膜(PVP Free)，膜上铺Matrigel胶(用无血清RPMI 1640培养基稀释)。分别取以上2组细胞，用RPMI 1640调整浓度至1×106mL-1，上室内滴入上述细胞悬液400 μL/室(即4×105个细胞/室)。37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养12～24 h。小心将聚碳酸酯膜取出，用湿棉签轻轻擦去膜表面未侵袭的细胞，在室温下用体积分数95%乙醇固定，常规HE染色，中性树胶封片。每种细胞均设正常氧浓度对照组和缺氧实验组(培养48 h)，每组设5个平行样本。高倍镜下计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数，每张聚碳酸酯膜选取6个视野，计数每个视野(200倍光镜下)的穿膜细胞数，以穿膜细胞的相对数目表示细胞侵袭力的大小。

1.4统计学处理采用SPSS 23.0进行分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较缺氧对膀胱癌细胞5637和T24细胞体外黏附的影响，采用两独立样本的t检验比较缺氧条件下膀胱癌细胞5637和T24细胞侵袭能力的变化。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1缺氧对膀胱癌细胞5637和T24细胞体外黏附的影响见表1。实验结果显示，与正常氧浓度对照组相比，缺氧24 h后5637 和T24细胞的黏附能力无明显变化(P>0.05)，缺氧48 h和72 h后2种细胞的黏附能力明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同缺氧时间对膀胱癌细胞黏附率的影响(n=6) %

2.2缺氧条件下膀胱癌细胞5637和T24细胞侵袭能力的变化高倍镜下计数穿膜细胞数，结果发现在缺氧条件下5637细胞组穿膜细胞数(42±4)高于正常氧浓度对照组(19±2)(t=86.229，P<0.001)；缺氧条件下T24细胞组的穿膜细胞数(48±5)明显高于正常氧浓度对照组(20±3)(t=42.882，P<0.001)。

3 讨论

缺氧是实体肿瘤微环境的重要特点。肿瘤细胞具有增殖快、代谢高的特性，所以氧气的消耗远远大于正常细胞，造成微环境中的氧含量下，降导致缺氧[2]。有研究[3]发现，肿瘤周围氧含量较正常组织中低。缺氧是重要的微环境因素，导致肿瘤恶性转化、疾病的进展、肿瘤的异质性、免疫逃逸和治疗抵抗[4-5]。肿瘤组织内部的缺氧，促进肿瘤众多恶性表型的发生和细胞的去分化，也可诱导下游众多基因的表达发生改变，从而诱导肿瘤新生血管的生成和抗凋亡能力的形成，并促进肿瘤侵袭和转移的发生[6]。根据肿瘤分化越低、恶性度越高、预后较差的特点，一致的观点是缺氧诱导的去分化引起肿瘤的异质性使肿瘤细胞发生恶性转化，增加了肿瘤细胞的侵袭性。因此作者体外制备缺氧的环境，观察不同分化来源的膀胱癌细胞(中分化的膀胱移行细胞癌细胞系5637、低分化的移行细胞癌细胞系T24)在缺氧环境中的生物学特性，以此为临床上阻止膀胱癌侵袭和转移的治疗提供充分的理论依据。

结果发现，与对照组相比，缺氧24 h时两种不同分化的膀胱癌细胞的黏附能力及侵袭力差异无统计学意义，而缺氧48 h后两种细胞黏附力及侵袭力较对照组相比明显增加，差异有统计学意义，提示膀胱癌细胞缺氧处理后黏附能力和移行能力均有明显增强，表明缺氧可能促使膀胱癌细胞活力增加。

总之，作者的研究结果显示，缺氧条件下膀胱癌细胞的黏附和迁移能力增强，随着研究的进一步深入，抗缺氧有望成为一个新的抗肿瘤治疗的靶点。

[1] REN Y,HAO P,LAW SK,et al.Hypoxia-induced changes to integrin α 3 glycosylation facilitate invasion in epidermoid carcinoma cell line A431[J].Mol Cell Proteomics,2014,13(11):3126

[2] HARRIS AL. Hypoxia:a key regulatory factor in tumour growth[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):38

[3] CASAZZA A,DI CONZA G,WENES M,et al.Tumor stroma: a complexity dictated by the hypoxic tumor microenvironment[J].Oncogene,2014,33(14):1743

[4] FERREIRA JA, PEIXOTO A, NEVES M, et al. Mechanisms of cisplatin resistance and targeting of cancer stem cells: adding glycosylation to the equation[J]. Drug Resist Updat,2016,24:34

[5] CHOUAIB S,NOMAN MZ,KOSMATOPOULOS K,et al.Hypoxic stress: obstacles and opportunities for innovative immunotherapy of cancer[J].Oncogene,2017,36(4):439

[6] CHAFFER CL, WEINBERG RA. A perspective on cancer cell metastasis[J].Science,2011,331(6024):1559

[7] JOU YC,TSAI YS,LIN CT,et al.Foxp3 enhances HIF-1α target gene expression in human bladder cancer through decreasing its ubiquitin-proteasomal degradation[J].Oncotarget,2016,7(40):65403

(2017-02-22收稿 责任编辑赵秋民)

Effects of hypoxia on adhesiveness and invasiveness of bladder carcinoma cells

FANChanghui,XUChangbao,HAOBin,WUGuoqing,ZHAOXinghua

DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

bladder carcinoma；hypoxia；adhesiveness；migration

Aim: To study the effects of hypoxia on adhesion and migration of bladder carcinoma cell line 5637 and T24invitro. Methods: The bladder carcinoma cells 5637 and T24 were cultured in hypoxic condition(10%O2,5% CO2,85%N2mixed gas), while those put into 5% CO2,37 ℃ incubator were control group. The influence of hypoxia on the adhesiveness and invasiveness of the 2 kinds of cells were detected by MTT and Boyden method, respectively. Results: The result showed that the adhesiveness ability of 5637 cells and T24 cells was enhanced with culture time in hypoxic condition and the normal oxygen condition(P<0.001). Compared with those cultured in normal oxygen condition, the adhensiveness of the 2 cells cultured in hypoxic condition did not change significantly after 24 h culture(P>0.05)， but increased after 48 or 72 h culture(P<0.05).The migration ability of the 2 kinds of cells was enhanced after cultured in hypoxic condition than that of control group (P<0.001). Conclusion: The adhesiveness and migration ability of bladder carcinoma cells are enhanced in hypoxic condition.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.015

*河南省卫生科技创新性人才工程中青年科技创新人才基金资助项目 4118

R737.14

#通信作者，男，1965年10月生，本科，教授，研究方向：泌尿系肿瘤，E-mail：495975452@qq.com