纳米孔测序技术发展态势分析

丁陈君，陈方，陈云伟，郑颖，邓勇

中国科学院成都文献情报中心，成都 610041

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纳米孔测序技术发展态势分析

丁陈君，陈方，陈云伟，郑颖，邓勇

中国科学院成都文献情报中心，成都 610041

纳米孔测序技术以其快捷、低成本和可测长片段DNA等优势而备受瞩目。为了解该技术领域的发展态势，利用文献计量和专利分析的方法对纳米孔测序技术的学术研究和专利申请情况进行定量分析。在应用前景方面，纳米孔测序技术应用领域广泛，在即时检测传染源、基因组组装、基因诊断和太空应用方面都有不错的表现，但未来该技术在错误率和平行能力方面仍需改进。

纳米孔；基因测序；文献计量；专利分析

自2003年“人类基因组计划”完成之后，测序技术发展迅猛，测序读长不断加长、通量不断提升、时间不断缩短，基因组测序技术成本大大降低，逐渐成为一项常规技术，测序物种数量和物种多样性与日俱增。2005年，第二代测序技术即高通量测序技术应运而生，并得到广泛应用[1]。

纳米孔测序技术是近年来在基因测序领域兴起的一项新技术，起源于1996年哈佛大学的Daniel Branton、加州大学的David Deamer等用膜通道检测多核苷酸序列的实验结果[2]。其主要原理是让单链DNA的碱基逐个穿过1nm的小孔，检测不同碱基组合的特有结构在穿过时产生的电流变化来进行测序。该测序技术无需预先扩增或标记DNA，可以降低测序成本，且可以连续读取长片段的DNA序列，分析速度也大大提高，基于这些优势该技术已受到广泛关注，被认为是最有可能成为下一代基因测序的技术之一。2016年，《科学》杂志已将基于纳米孔的便携式检测技术评为十大科技突破之一。2014年6月，瑞士罗氏集团收购纳米孔测序公司Genia Technologies。该次收购将加强罗氏新一代测序平台。几乎同期，罗氏还收购了另一家纳米孔测序公司Stratos Genomics。此外，作为牛津纳米孔技术公司早期的主要股东之一的Illumina公司迫于竞争压力不得不与牛津纳米孔技术公司对簿公堂，以抢占该领域的核心专利。Illumina和罗氏公司加紧在纳米孔测序技术领域的布局凸显了该技术广阔的发展前景。

纳米孔测序技术自其理论诞生以来已发展了20年，最初的理念非常直观，但实施过程中遇到很多问题。在美国国立卫生研究院“1000美元基因组计划”的激励下，越来越多的研究人员加入到解决碱基穿过纳米孔时的检测手段、穿过速度以及纳米孔本身的改良等技术难题的行列。

2005年，由于IP集团种子基金的资助，英国牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）成立，并于2012年发布其纳米孔测序平台——MinION。该平台只有U盘大小，价格仅1000美元左右，能对很长的DNA进行测序，由此开启了纳米孔测序技术的商业化新篇章。2013年11月，该公司启动MinION测序仪的早期试用计划。2014年的基因组生物技术进展大会上，首批试用数据公布于众。随后其他各试验项目的数据陆续发布。英国埃克塞特大学研究小组对MinION的性能进行了评估，他们认为作为首个基于纳米孔的单分子测序仪，MinION前景值得期待，但目前约38%的错误率则限制了其竞争力[3]。瑞典于默奥大学研究小组利用MinION构建细菌基因组骨架，序列读取还有待改进，但未来在组装基因组、现场快速检测生物体方面的应用令人期待[4]。

2009年3月，美国纳米孔测序公司Genia Technologies成立，其传感器技术及其专有的NanoTag化学技术可以实现准确读取，克服了早期纳米孔测序工作面临的诸多限制。

2015年，牛津纳米孔技术公司创始人Hagan Bayley和牛津大学等研究人员在高通量检测纳米孔离子流变化情况方面取得突破性进展。他们开发了光传感纳米孔芯片，将纳米孔离子流变化转化为荧光变化，从而进行高通量检测[5]。2016年3月，美国哈佛大学和哥伦比亚大学团队开发了基于纳米孔的单分子边合成边测序（SBS）系统，可以在单分子水平上对多个DNA模板进行平行测序，分辨率达到了单碱基水平[6]。

1 研发现状分析

1.1 文献计量

以科学引文索引扩展版（science citation index expanded，SCI-E）作为数据源对纳米孔测序技术进行文献检索，文献类型不限，相关论文共1091篇（检索时间2017年4月5日）。

通过对纳米孔测序技术的论文进行统计后发现，该技术论文数量增长较为缓慢，说明其技术发展较为慢热（图1）。随着技术的不断发展，商业化进程的推进，纳米孔测序技术也将日益受到关注。

1.1.1 国家分布

图1 纳米孔测序技术论文发表年度分布

从发文量TOP10国家来看，美国具有绝对的优势，共发表纳米孔测序技术领域的论文548篇，是排名第二的中国的近3倍。英国排名第三，排名第4～10的国家发文量差异不明显（表1）。

从被引情况来看，发文量TOP10国家中，篇均被引次数前三的分别是英国、加拿大和美国，分别为50.37、48.63和38.08次，篇均被引次数最少的是瑞典，为11.3次（表1）。将被引次数50以上的论文作为高被引论文进行统计发现，美国、英国和中国的高被引论文发文量居于前三；加拿大、荷兰和瑞士高被引论文量占发文总量的比例最大，其次是美国和英国（表2）。结合发文量和被引情况可以看出，美国、英国和加拿大在纳米孔测序技术领域相对具有较强的研发实力。

1.1.2 主要研究机构

在开展纳米孔测序技术研究的机构中，美国加州大学系统发表相关论文数量最多（78篇），美国伊利诺伊大学系统和中国科学院分别发表65篇和46篇，位列第二和第三（图2）。在发文量前十位研究机构中，有7家美国机构，2家中国机构和1家英国机构。

1.1.3 国际合作

从开展纳米孔测序技术研究的机构合作情况来看，位于前十的机构除加州大学圣克鲁兹分校与华盛顿大学和加州大学圣克鲁兹分校与哈佛大学之间的合作较频繁之外，其余几所机构之间的合作并不紧密。美国犹他大学几乎独立开展研究（图3）。包括中国科学院在内的这些机构都位于小的合作网络中心，说明这些机构都具有较强的研发水平，开展以各自为主导的国际合作研究。

表1 发文量TOP10国家及其论文被引情况

表2 高被引论文发文量TOP10国家

图2 纳米孔测序技术论文发文量TOP10机构

图3 纳米孔测序技术研究机构合作网络

1.2 专利分析

以汤森路透Web of Science平台中Derwent Innovations IndexSM数据库（DII数据库）作为数据源，分析纳米孔测序技术专利的发展情况（数据下载日期为2017年5月31日）。

1.2.1 时间趋势

从图4可以看出纳米孔测序技术相关专利保护情况的年度发展趋势，1999～2016年该技术发明专利数量总体呈缓慢增长趋势，1999～2004年主要处于技术引入期，2005～2009年专利公开数量没有大的突破，处于技术瓶颈期，许多技术仍处于研发阶段，2010年以后纳米孔测序技术进入快速发展阶段，尤其是2012年首台测序仪问世标志着技术真正实现商业化，专利公开数量激增，至2016年已达到101件（图4）。这一趋势说明纳米孔测序技术已逐渐受到各界重视。

1.2.2 专利受理国家/地区分布

由相关专利受理国家/地区分布情况可以看出，美国、欧洲、中国是纳米孔测序技术专利申请人最重视的市场保护地，其次是日本、加拿大、澳大利亚（图5）。

图4 纳米孔测序技术相关专利公开量年度趋势

图5 纳米孔测序技术专利受理国家/地区分布

1.2.3 主要申请机构

由纳米孔测序技术的主要申请机构可以看出，英国牛津纳米孔技术公司、美国Genia Technologies公司和美国Paci fi c Biosciences公司的专利申请数量居全球前三。专利申请数量TOP10机构中，除英国牛津纳米孔技术公司和瑞士罗氏公司以外，其余8家机构均为美国机构，其中6家为美国公司，还有2家为加州大学和哈佛大学，可见美国在该领域具有垄断优势（图6）。

1.2.4 相关专利的研发重点

将纳米孔测序技术专利根据国际专利分类号进行分类，专利申请数量最多的10个分类号如表3所示。根据分类号对应的注释可知，目前纳米孔测序技术相关专利主要集中在包含酶或微生物的测定或检验方法；其所用的组合物或试纸；组合物的制备方法；在微生物学方法或酶学方法中的条件反应控制（C12Q）领域，其次是借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料（G01N）领域等。

2 应用前景

2.1 即时检测传染源

第二代测序平台的广泛使用，填补了之前在传染病爆发时诊断检测方面的缺口，但与PCR、ELISA技术一样，存在检测时间过长的问题，而纳米孔测序技术能很好地弥补这方面的不足。

2015年4月，欧洲移动实验室项目（EMLP）成员和美国NIH的团队利用MinION测序仪在48h内读取了14名患者的埃博拉基因组，由此帮助医生诊断患者病因，并快速绘制系统发育树，从而确定感染的源头。2016年2月3日，Nature首次报道了利用纳米孔测序技术对埃博拉病毒进行实时测序的成功例子[7]。

2.2 基因组组装

图6 纳米孔测序技术专利申请TOP10机构

英国埃克塞特大学在评估MinION系统时发现，结合Illumina MiSeq数据，并依靠其长读长的优势在基因组复杂区域组装方面具有良好的效果[3]。

2016年12月初，牛津纳米孔技术公司主办的行业交流会上宣布首次使用Oxford Nanopore掌上测序仪完成了对一个人类标准样本NA12878的测序和一位牛津生物医学研究中心的患者的测序，由此打开了大规模使用纳米孔测序技术的大门。

2.3 基因诊断

哈佛大学研究小组开发了一种基于纳米孔的电子DNA测序平台。这个新的测序机器包括7个蛋白质亚基，共同组成了1个复杂的纳米孔，其中只有1个可以在正确的孔道开放时间、正确的位置特异性地与DNA聚合酶共轭[8]。该成果将生物大分子机器与合成膜结合在一起，然后整合到常规电子机器中，创造了一种全新的低成本基因诊断技术。

表3 纳米孔测序技术相关专利前十位国际分类号

2.4 太空应用

2016年7月，一台MinION测序仪搭乘SpaceX 9号进入国际空间站，对细菌、病毒和小鼠DNA进行测序，所得数据发回地球，在此基础上研究人员对MinION在不同环境下的工作状态进行评估，以验证MinION在微重力下的性能，并为下一步探索做好准备，为未来更多科学研究提供支持。

此外，小型便携式DNA测序仪还在科研、药物定制、食品安全检测、农作物科学研究、环境监测以及安全防护等许多方面具有应用潜力，在推进基于基因组技术的个性化医学方面也将做出巨大贡献。

3 结 论

通过文献计量和专利分析来看，目前纳米孔测序技术仍处于发展初期，许多技术还在研发阶段，受关注程度不太高。美国、中国和英国在纳米孔测序技术领域发文量方面居前三位。美国和英国在高被引论文发表数量和发文总量占比方面处于领先地位。在专利申请方面，产业界的申请人占多数，美国专利权人在纳米孔测序技术专利申请方面具有垄断优势。加州大学和哈佛大学在论文发表和专利申请方面都居于世界前列。中国科学院和东南大学是发表相关论文总数进入TOP10机构。由发文量、发文质量和专利申请数量的机构排名可以看出，美国和欧洲都具有很强的研发实力，并且这些国家/地区的市场也十分受重视。

目前，纳米孔测序技术正向着长读长、高通量、低成本和小型化的方向发展，与其他主流测序技术相比，在速度和成本方面已显现一定的优势，并且应用领域相当广泛。未来，该技术在从测序原理到制造工艺，尤其是序列读取错误率和平行测序能力方面还有很大的改进空间。

［1］ FULLER C W，MIDDENDORF L R，BENNER S A，et al. The challenges of sequencing by synthesis[J]. Nature Biotechnology，2009，27（11）：1013-1023.

［2］ JOHN J K，ERIC B，DANIEL B，et al. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（24）：13770-13773.

［3］ LAVER T，HARRISONET J，O’NEILL P A，et al. Assessing the performance of the Oxford Nanopore Technologies MinION[J]. Biomolecular Detection and Quanti fi cation，2015，3：1-8.

［4］ KARLSSON E，LÄRKERYD A，SJÖDIN A，et al. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing[J]. Scienti fi c Reports，2015.DOI：10.138/srep11996.

［5］ HUANG S，ROMERO-RUIZ M，CASTELL K O，et al. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array[J]. Nature Nanotechnology，2015，10：986-991.

［6］ CARL W F，SHIV K，MINTU P，et al. Real-time single-molecule electronic DNA sequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on a nanopore array[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（19）：5233-5238.

［7］ JOSHUA Q，NICHOLAS J L，SOPHIE D，et al. Real-time，portable genome sequencing for Ebola surveillance[J]. Nature，2016，530（7589）：228-232.

［8］ STRANGES P B，PALLA M，KALACHIKOV S，et al. Design and characterization of a nanopore-coupled polymerase for single-molecule DNA sequencing by synthesis on an electrode array.[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（44）：E6749-E6756.

Analysis on development trend of nanopore sequencing technology

DING Chenjun，CHEN Fang，CHEN Yunwei，ZHENG Ying，DENG Yong
Chengdu Library and Information Center, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China

Nanopore sequencing technology with its fast, low cost and measuring long DNA fragments and other advantages has attracted much interest. Combined with bibliometric and patent analysis methods, the present situation of research and patent application status of the technology were analyzed in this paper. It shows a great application prospect in real-time detection of infection, genome assembly, genetic diagnosis and space applications, but the technology need to be improved in sequencing error rate and parallel capacity.

nanopore; gene sequencing; bibliometrics; patent analysis

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.001

丁陈君，博士，副研究员。主要从事生物技术及生物产业领域情报研究工作，包括领域态势分析、引文网络分析、热点主题挖掘等。E-mail：dingcj@clas.ac.cn