T细胞受体工程T细胞疗法：战略和挑战

施炜星，杨春霞

上海宇研生物技术有限公司，上海 200333

T细胞受体工程T细胞疗法：战略和挑战

施炜星，杨春霞

上海宇研生物技术有限公司，上海 200333

施炜星，博士，教授，中组部国家千人计划专家，江苏西迪尔生物技术公司总裁,上海宇研生物技术公司首席科学家。中科院上海生化所博士，美国加州大学圣地亚哥分校癌症中心博士后，师从国际著名生物学家、美国科学院院士Ajit Varki 教授。曾在美国强生(Johnson & Johnson) 制药公司从事特异性免疫细胞治疗和临床研究15余年，独创性地开创了确定肿瘤标志物的平台，并运用独特的抗原递呈细胞株结合肿瘤抗原建立了免疫细胞治疗肿瘤的平台技术，是美国大型制药公司在肿瘤治疗领域最早用特异性T细胞开展肿瘤治疗研究和临床的科学家之一。江苏省科技协会常务理事，上海精准医疗协会第一届委员会委员，浙江理工大学兼职教授。曾获2014年江苏省双创人才、2014年中国医药城创新创业大赛一等奖、上海科学技术委员会2016年特异性免疫细胞治疗项目基金资助。E-mail：weixingshi@yahoo.com

T细胞受体工程T细胞疗法（TCR-T）是肿瘤治疗中很有希望的一种特异性过继性细胞免疫疗法，该方法主要是将肿瘤抗原特异的TCR基因通过载体转入自体的淋巴细胞中，再回输至病人体内以达到杀伤肿瘤细胞的目的。目前对TCR-T的挑战是肿瘤抗原特异的高亲和性的TCR基因的获取和高度表达以及TCR双链α和β的正确配对。除此之外，通过临床试验已经发现，由于TCR的高反应性，TCR-T会在靶向肿瘤细胞表面抗原的同时作用于正常组织而产生强的脱靶效应，因此，选择合适的靶抗原也是TCR-T细胞治疗能够发挥其优越效果的关键因素。对TCR基因的表达和调节机制、TCR配对的优化战略等TCR-T在肿瘤治疗中面临的挑战，以及TCR-T的临床转化和应用价值进行了探讨。

T细胞受体；过继性细胞治疗；TCR-T；脱靶效应；临床试验

过继性细胞治疗（adoptive cell therapy，ACT）是目前正快速发展的肿瘤细胞免疫治疗方法[1-2]。早期的过继性细胞免疫治疗主要是把自体或异体肿瘤反应性T细胞回输到患者体内，使患者肿瘤消退，这种方法在白血病和黑色素瘤治疗中已经取得一定的成功。自然发生的肿瘤浸润性 淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）已经证明对转移性黑色素瘤患者有49%～72%的客观应答率[3]。在黑色素瘤患者中，使用克隆的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocytes，CTL）也显示出介导肿瘤消除的效果，但是应答率低于10%[4]。虽然TIL疗法表现出一定的效果，但是到目前为止，TIL细胞仍没有被广泛应用，原因在于TIL疗法有较多应用的限制。首先，有抗肿瘤活性的TIL必须是由肿瘤产生的，且要有足够的数量。除此之外，TIL的一个最大应用限制在于这种疗法不能使机体自主产生有抗肿瘤活性的T细胞[5]。

最近的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors，CAR）T细胞技术（CAR-T）以及TCR-T技术作为免疫细胞治疗的最新、最有效的技术，受到了广泛的关注和研究。CAR-T和TCR-T 都是通过识别肿瘤抗原来杀死肿瘤细胞的，但两者在肿瘤抗原识别和受体结构方面相差很大。构建CAR基因结构相对容易，它含有识别肿瘤抗原的单链抗体（scFv）序列和胞内信号转导区域，可以直接激活T细胞。CAR-T在治疗复发性或难治性血液系统恶性肿瘤上已经产生了惊人的结果，但是由于实体瘤的异质性以及免疫微环境的抑制作用，CAR-T实体瘤的治疗还有待进一步研究[6]。而TCR-T细胞中转导了TCR的α链和β链，α链和β链依赖T细胞内的CD3分子和一些共刺激分子传导信号，最终激活T细胞。TCR基因的构建相对复杂，TCR基因表达有主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的限制，需要对TCR的α链和β链亚型鉴定，优化配对后才能获得高亲和性的TCR序列。一些报道已显示TCR-T在治疗晚期滑膜肉瘤和恶性黑色素瘤上效果比较明显[7]，较之于CAR-T细胞治疗，TCR-T具有一些关键优势。①通过使用完整的TCR复合物的全信号能力，更强、更全面地激活工程化的T细胞；②MHC分子对肿瘤表面抗原的独立识别；③在免疫突触中可募集与TCR自然结合的所有共刺激受体；④具有对抗T细胞衰竭和免疫抑制性肿瘤微环境的措施。TCR-T是从有靶向肿瘤活性的T细胞中克隆出TCR基因之后转导到正常T细胞里而得到TCR工程化的T细胞。这种经TCR工程化的T细胞能在体外培养中产生大量肿瘤抗原特异性的CTL细胞，发挥细胞毒性作用，回输到体内后，增强免疫系统介导的对肿瘤细胞的消除，特异地靶向和杀伤肿瘤细胞，用于对肿瘤患者的治疗。随着高通量测序技术的发展，单细胞克隆的TCR基因的鉴定工作也较以往更加简单[8]。因此，这种以TCR为基础的免疫细胞疗法显示出了无可取代的优越性。以下将重点介绍在TCR工程化T细胞应用中特异的肿瘤抗原的选择、TCR基因表达和配对、高亲和力TCR的筛选等挑战性问题，以及TCR-T临床试验方面的研究进展。

1 TCR-T细胞治疗中的抗原选择

TCR-T细胞治疗的第一步是选择适当的肿瘤抗原特异的T细胞。一般肿瘤抗原分为两类，第一类是病毒来源的或仅在肿瘤组织上表达的肿瘤特异性抗原（tumor speci fi c antigen，TSA），大多数TSA是由基因的随机突变引起的，在不同的患者之间差别很大。第二类是肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA），许多人类TAA是非突变的自身抗原，在不同个体间共同表达，这些正常的分化抗原，在肿瘤细胞中过度表达。目前，几乎所有临床试验中的TCR-T细胞治疗所选择的靶点都是针对TAA进行的，如gp100、MART-1、Tyrosinase[9-10]等。

除了TAA，许多研究集中在癌睾抗原（cancertestis antigen, CTA）。CTA是一种免疫原性蛋白，通常在非MHC表达的睾丸生殖细胞中正常表达，已发现胎儿时期的卵巢能表达多种CTA，成人的卵巢也有少量表达。另外，一些研究也发现CTA并不严格限制于正常睾丸中表达，在其他一些正常组织上也有表达。CTA在许多肿瘤细胞中是异常表达的，CTA基因大多定位在人类X染色体上，第一个CTA MAGE-A1是在黑色素瘤患者体内发现的。现在许多CTA基因被确定在多种肿瘤上表达，如黑色素瘤、膀胱癌、肺癌和肝癌。除了MAGE家族基因，NYESO-1也在各种肿瘤中广泛表达，以NY-ESO-1为靶点的TCR-T疗法也取得了较好的效果[11]。靶向CTA的优点在于T细胞会选择性地消除肿瘤细胞，并避免或减少对正常组织的毒性。

除此之外，突变抗原也成为TCR-T靶标选择的新热点。突变抗原由于其在肿瘤细胞中特异性突变的特点，使得TCR-T细胞治疗不会靶向正常细胞或组织，增加了其安全性并减小了脱靶效应的风险。Inderberg等[12]用转移生长因子β受体II的移码突变（TGFβRIImut）产生的新型多肽筛选出阳性CTL克隆并鉴定其TCR序列，该突变在15%散发性结直肠癌患者中发现，由该TCR基因转导的T细胞显示出明显抑制结肠癌细胞生长，增加NOD/SCID荷瘤小鼠生存率的特点。

2 TCR的表达

成熟T细胞表面表达大约10 000～40 000个TCR分子，表达水平与抗原反应性直接相关。TCR是由两条多肽链组成的异源二聚体，αβ链（约95%T细胞表达）或γδ链（约5% T细胞表达），其结构与免疫球蛋白类似，每条链均由可变区和恒定区组成，且通过二硫键连接。每条链的可变区有3个互补决定区（complementary determining region，CDR），CDR可识别各类抗原，与MHC-多肽分子形成复合物。它们的胞内区需要与T细胞内的CD3分子形成复合物才能发挥其信号传递功能，其中TCR的β链恒定区（Cβ domain）在TCR与细胞内CD3分子信号传递的过程中起重要作用[13]。当TCR与CD3复合物的组分CD3γδζ完全组装时，TCRαβ分子能在细胞表面表达。不完全的组装会导致蛋白质保留在细胞内并最终在内质网中降解。因此，当将外源性TCR引入成熟T细胞时，其将与内源性TCR产生竞争CD3分子的关系，可能会阻碍外源TCR的表达[14]。

2.1 表达系统的选择

TCR转染的研究大多采用γ逆转录病毒载体系统或者是慢病毒载体系统[15]。除了极少数几例在治疗免疫缺陷病时用基因转染造血干细胞时出现插入突变以外，在过去的二十年里，几乎没有与γ逆转录病毒载体基因转移系统相关的安全性问题的报告。虽然γ逆转录病毒载体是在临床试验中基因转染的首选系统，但该系统需要通过TCR激活T细胞以诱导细胞分裂，这可能对它们在体内扩增有一定的局限性。作为替代，慢病毒载体被开发用于TCR转导的TCR-T的肿瘤免疫治疗。慢病毒系统有在缺失TCR活性时转染T细胞的优势，可以促进完全静止T细胞的转化，不需要提前刺激，因此能维持转染的细胞在低分化状态，这对过继性免疫细胞疗法是有一定好处的。另外，不像γ逆转录病毒载体优先整合在基因转录起始位点，慢病毒载体由于其随机整合，不容易产生插入突变。

转座子是一个相对较新的基因转移系统，更容易操作且需要较少的前期安全测试[16-17]。与逆转录病毒不同，转座子能够完全转化非活化的静止细胞，并且不优先整合入启动子区域，这可能使其在插入转化方面更加安全。使用这些方法，基因工程修饰的T细胞能够在短期扩增，并显示出抗原刺激，分泌细胞因子和肿瘤溶解的能力。与病毒上清液相比，大规模生产转座子质粒DNA所耗资金成本与时间都较少，因此转座子介导的TCR基因的表达系统已被证明是可与γ逆转录病毒和慢病毒载体的基因转移系统相媲美的表达系统。

TCR分子是异源二聚体，因此基因的表达需要同时表达α链和β链。虽然可以用两个独立的载体表达两个基因，但是这种方法效率不高，并且会增加插入诱变的风险。因此，在研究中，一般由两个启动子或者用IRES序列链接。位于IRES下游的基因的表达水平要比IRES上游的基因略差，这可能会导致TCR的表达水平不是太好，产生较差的T细胞反应。最近有一些新的有利于两条链的平行表达的转基因盒被构建出来，比如利用细小核糖核酸病毒来源的2A接头肽。2A肽是首先在小核糖核酸病毒中发现的一种具有“自剪切”功能的肽链，具有2A肽连接的载体能够产生单独编码TCRα链和TCRβ链的mRNA。在翻译期间，核糖体在2A肽序列处的“跳跃机制”会造成两种蛋白质的分离。与IRES元件相比，上游基因的表达不受阻碍，可使α链和β链同时优化表达[18]。

2.2 T细胞的选择

如果用同时编码TCRα和TCRβ基因转入多克隆的T细胞群，会发现一些T细胞仅表达转入的α链，另一些T细胞仅表达β链。也就是说，不同的细胞表达TCR的水平是不同的，细胞内源性的TCR会对转入的TCR表达水平有一定的影响[14]。因此选择一个表达较“弱”的TCR的T细胞进行转导，使外源的“强”TCR替代内源的“弱”TCR，是一个可行的解决方案。

2.3 密码子优化

一些报告指出，TCR在细胞表面的表达可以通过优化密码子来增强[19]。如修饰翻译起始区或mRNA结构元件，用高表达量的人类基因中分布最频繁的密码子取代T CR基因中的稀有密码子，删除富含AT或GC的序列，隐藏拼接RNA不稳定序列等。在乳头瘤病毒E7特异性TCR的初始研究中，优化mRNA序列导致转导的外周血淋巴细胞中TCR表达水平的升高。在其他人类和鼠类TCR上也发现了同样的效果，并且鼠类TCR的密码子优化提高了小鼠模型中TCR-T的抗肿瘤功效。

2.4 RNA干扰

有报道指出，小干扰RNA（siRNA）可特异性下调内源性TCR的表达，导致转入TCR的表达和活性的提高[20]。针对TCRα链和β链的恒定区特异性的siRNA可以被整合到逆转录病毒TCR编码载体中，导致被转化的T细胞中内源性TCR的mRNA的显著减少。同时，转入的TCR基因可以通过密码子的优化来保护其免受RNAi效应，使转入的TCR在T细胞中的表达和体外功能均有所增加。

3 优化TCR的配对

由于转基因的TCR与细胞表面表达的内源性TCR存在一定的竞争关系，TCR表达的一个潜在问题在于内源性TCR链和引入的TCR链会形成混合二聚体。肿瘤特异性错配异源二聚体的出现会导致两个主要后果。首先，它减少了在细胞表面上正确配对的治疗性TCR的量，从而有可能降低TCR-T细胞的功能反应性。第二，当引入的TCR的单链与其内源性TCR链配对时，就会形成具有不可预测的特异性受体，因为它们没有在胸腺中经过自然选择，会具有自身反应性的风险[21]。而形成混合二聚体所造成的相关的毒性已在体外和小鼠模型中被观察到。现在研究人员已经研发出策略，以防止混合二聚体的形成[19]。

3.1 TCR恒定区的鼠源化

鼠-人杂交TCRs，即人类受体的恒定区被鼠源受体恒定区所取代。与野生型受体相比，通过这种方式杂交的TCR表达水平和功能有所升高，也显示出了工程T细胞更好的功能，包括高水平的细胞因子释放和细胞杀伤活性[19]。最小的鼠源化TCR变体仅含有小鼠序列的9个残基，并且与完全鼠源化的TCR类似，可以增强人源TCR的表达程度。因此，最小的鼠源化TCR大大降低免疫原性的风险，同时保留鼠源化的积极效果[14]。

3.2 恒定区引入半胱氨酸残基

TCRα链和β链可以通过恒定区中的半胱氨酸二硫键共价连接，比如在TCRα链和β链的恒定区引入额外的半胱氨酸残基，可以增加TCRα链和β链的配对效率。研究显示，与野生型对相比，经半胱氨酸修饰的TCR相比于野生型TCR与HLA-A2的结合能力更佳[22]。但是最近也有研究发现，经二硫键修饰的TCR在人T细胞的表达量并没有增加，也不能完全避免与内源性TCR发生错配[19]。

3.3 嵌合TCR分子

有报道提出用嵌合的TCR分子，可以减少错配的异源二聚体形成。Willemsen等[23]构建出单链和双链嵌合的TCR分子，不仅不与内源表达的TCR链配对，而且在体外能够识别MAGE-A1/HLA-A1阳性肿瘤细胞。然而，单链构建体与天然TCR相比，其亲和力出现了降低，并且在体内肿瘤模型的测试中发现单链TCR具有较低的效率。Govers等[24]用TCR链与CD3ζ融合的方法产生了具有高度优先配对功能的抗原特异性受体。Tao等[25]最近将αβ链TCR的恒定区用γδ链TCR的恒定区替代，产生新的嵌合体TCR，该嵌合体TCR显示出更高的配对效率并且不影响转基因T细胞的功能。

3.4 用γδT细胞转入TCRαβ基因

避免错配一个非分子生物学方法是使用γδT细胞转入TCRαβ基因，因为TCRγδ链不能与TCRαβ链形成异源二聚体。用MHC限制性TCRαβ基因转化的鼠γδT细胞能够裂解肿瘤细胞，分泌细胞因子IFN-γ和IL-4，并表现出强的抗白血病细胞的活性[26]。在该研究者在另一篇论文中显示TCRαβ链转化的γδT细胞在抗原特异性刺激后能在体内持续增殖，不会出现异源二聚体，在小鼠中显示出了抗肿瘤的效应功能[27]。尽管这些数据显示出建立的γδT细胞在体内具有有效的抗肿瘤反应的能力，但有些关键问题如归巢到肿瘤位点和浸润性仍需证明[14]。而且，此方法也有一定的缺点，比如外周血T细胞中γδT细胞仅占1%～10%，γδT细胞在过继性细胞治疗中的功能性和持久性还有待研究。

4 提高TCR的亲和力

除了提高TCR表达水平和优先配对，TCR基因疗法的关键还在于分离出一个对确定的靶抗原有高亲和力的T细胞克隆。TCR的基因可以从有罕见高反应性及高亲和力的T细胞的病人中分离，TCR工程化的TCR-T细胞可以识别和裂解肿瘤细胞[28]。由于患者的免疫细胞会对其自体的肿瘤细胞产生免疫耐受，因此研究人员提出了一系列提高TCR亲和力，克服患者对自身肿瘤抗原耐受的策略。

4.1 转基因小鼠产生TCRs

采用HLA转基因小鼠产生抗人肿瘤抗原的TCR。这种方法产生的TCRs亲和力较高。通过这种方法，已经分离出一些人类肿瘤抗原，如gp100、CEA和MAGE-A3特异性的小鼠TCR，并显示了一定的可行性[18]。从原理上说，人T细胞中表达鼠TCRs可能会产生潜在的抗转基因免疫应答，导致对人体转基因T细胞的排斥，但是目前还没发现这种现象。

4.2 同种异体产生TCRs

除了用转基因小鼠产生TCRs，已经开发出了使用同种异体抗原呈递细胞（APC）合并抗原肽刺激T细胞策略。在增殖产生的细胞毒性T细胞群中，再分离出抗原肽特异的具有高亲和力和高反应性的单细胞克隆，进一步克隆出TCR。到目前为止，已有报道使用类似方法分离了T细胞克隆和TCRs。研究显示，与从自体分离的T细胞相比，同种异体抗原肽特异性T细胞具有更好的抗肿瘤活性和更高的功能亲和力，并且这些性质可以在相应TCRs转导的淋巴细胞中复制[29]。

除了以上两种方法，酵母或噬菌体也显示出产生高亲和性TCRs的能力。酵母、噬菌体能够成功分离出亲和力高的成熟TCR，其Kd值在皮摩尔到纳摩尔之间。互补决定区α或β链的单个或两个的氨基酸替换已经显示出TCR亲和性的适度增加，可以增加T细胞的抗原特异的反应性[30]。另外，T细胞表面蛋白质氨基酸残基上的N-或O-糖基化具有免疫调节效应，例如降低CD8上的糖基的数目结果显示出了对pMHC和TCR信号传导亲和力的增加，在TCR链恒定区移除特定的N-糖基化链能够导致TCR在相似的表达水平下，出现亲和力的增加和肿瘤细胞的识别功能的增强[31]。笔者最近也应用了自创的人工抗原递呈细胞技术在体外制备肿瘤特异的CTLs，并与美国iRepertoire公司合作从肿瘤特异的CTLs中克隆了高亲和性的NY-ESO-1特异的TCR基因。

5 对细胞本身的要求

前文提到T细胞的选择会影响TCR的表达。同样，T细胞作为工程化T细胞的原材料也会影响TCR-T的疗效。

5.1 细胞产品的组成

TCR-T疗法是要求回输高度分化的CD8 T细胞给患者，它们一般有较好的细胞毒性，但缺乏足够的复制能力。由于CD4 T细胞能提供CTL细胞维持存活和功能所需要的细胞因子，现在已公认CD8 T细胞经常需要和CD4 T细胞一起使用。但面临的问题是，由于CD4和CD8 T细胞最佳培养条件是不同的，CD4 T细胞和CD8 T细胞在混合注入体内前是否需要分开培养。另一个问题是从病人身上是否需要分离所获取的细胞亚群。优点是分离细胞手段可以除去影响效应细胞的Treg细胞，以及白血病病人血液中的肿瘤细胞。但是，这些细胞操作会增加许多费用。

5.2 T细胞的最佳分化状态

注入的工程化T细胞需要最佳的分化状态才能增殖并且杀伤肿瘤细胞。除了基因工程给予T细胞对肿瘤的特异性识别，T细胞本身的特性也影响其疗效。T细胞从初始T细胞（TN）逐步分化成记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（TCM），这些细胞可以自我增殖，并且进一步分化成生存时间较短的效应记忆T细胞（TEM）和效应T细胞（TE），这些细胞可以用细胞表型分子CD62L和CCR-7来衡量。因此，选择分化程度较低的TN作为基因工程的原材料并确定回输的细胞处于最佳分化状态如TSCM或TCM，可能会提高工程化细胞在体内的疗效。

6 临床试验

Science杂志在2006年刊登了TCR-T细胞治疗的首次人体临床试验[32]。在I期临床试验中，TCR是从切除的黑色素瘤病灶中能识别MART-1的TIL中克隆得到，从HLA-A2阳性的转移性黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞用逆转录病毒转入了靶向MART-1的TCR。结果显示，在TCR-T细胞输注后，17例患者中有2例出现肿瘤消退，TCR-T细胞在回输后的1年依然能被检测到。2009年，有31例患者使用此方法治疗转移性黑色素瘤，4例患者（13%）出现了肿瘤的衰退[33]。

为了提高TCR的反应性，产生更有效的肿瘤反应率，可识别抗原MART-1（27～35表位）的高亲和力的TCR被克隆出来。在此临床试验中观察到30%的患者出现癌症衰退。但是，患者同时也表现出正常的黑素细胞在皮肤、眼睛和耳朵被损坏。这说明高活性表达的TCR-T细胞在介导肿瘤衰退的同时也作用到了全身表达相同抗原的正常组织或器官，即所谓的脱靶效应（on-target/off-tumor toxicity）。在另一项试验中，黑色素瘤细胞分化抗原gp100（154～162表位）被用作靶抗原，通过免疫HLA-A021转基因小鼠克隆出高反应性TCR。16例黑色素瘤病人入组该临床试验，其临床反应率为19%，并也在皮肤、耳朵和眼睛上观察到了类似的脱靶效应[18]。

TCR-T细胞治疗除了被应用到靶向黑色素瘤上的临床试验，也被应用到对其他癌种的细胞治疗中，如治疗转移性结直肠癌的TCR-T是靶向癌胚抗原（CEA）[34]。CEA是一种分子量为180kDa的肿瘤相关糖蛋白，在多种上皮性肿瘤中过度表达。3例转移性结直肠癌患者经TCR-T治疗均出现血清中CEA水平的下降（74%～99%），其中1例出现了可衡量的应答。由于CEA也在正常肠上皮细胞中表达，因此病人中也出现了一些可能是靶向正常组织CEA引起的短暂性大肠炎[34]。

癌睾抗原如NY-ESO-1在多种上皮性肿瘤和滑膜细胞瘤中都有高频率表达。NY-ESO-1是一个睾丸限制性CTA，它的表达仅限于正常成人睾丸组织，其细胞不表达HLA分子，因此不易被TCR识别。第一例临床试验使用自体淋巴细胞转入靶向NY-ESO-1的TCR在美国国家癌症研究所外科分会进行。在这项试验中，滑膜细胞肉瘤患者的应答率在66%（4/6），黑色素瘤患者的应答率为45%（5/11），两例黑色素瘤患者出现完全应答，没有病人在接受靶向NYESO-1的TCR-T细胞后出现脱靶效应[35]。这表明癌睾抗原可能是TCR-T细胞疗法的优秀靶标。

Morgan等[36]在2013年采用自体抗原MAGE-A3的TCR-T细胞治疗的临床研究中，9例病人中有5例患者经历了癌症的临床回归，有2例病人在输注后1～2天出现昏迷并死亡。对这2例病人的磁共振成像分析证实了脑室周围出现白质软化，尸检时发现脑部出现了坏死性脑白质病变，并伴有与CD3+/CD8+T细胞浸润相关的大规模白质缺陷。在该研究中使用了TCR识别MAGE-A3/A9/A12中的表位，而人类大脑样本进行分子试验表明MAGE-A12在人脑中表达。因此，这可能是TCR介导的炎症反应导致神经元细胞破坏的导火索。

另一项针对HLA-A01限制性的MAGE A3抗原（EVDPIGHLY）的TCR-T被用于临床试验，虽然临床前体外功能分析没有发现任何问题，但临床试验中有2例病人却出现了严重不良反应和对心脏组织致命的毒性。尸检结果显示严重的心肌损伤，组织病理学分析显示T细胞浸润，但是心脏组织未检测到MAGE A3基因的表达。使用氨基酸的扫描方法，找到了产生体内毒性的原因是TCR-T交叉识别了另一个心脏正常表达的目标肽肌联蛋白肽（ESDPIVAQY）并产生免疫反应[37-38]。

2014年，一项使用靶向MART-1基因的自体TCR-T细胞联合DC疫苗的临床试验在转移性黑色素瘤的患者中进行，13例病人中有9例（69%）显示肿瘤消退。MART-1特异性T细胞数量在治疗后2周内在外周血中达到峰值，表明体内快速扩增。说明TCR-T细胞联合DC疫苗的双细胞疗法是可行的[9]。

2015年，表达NY-ESO-1的HLA- 0201阳性患者的转移性滑膜细胞肉瘤或黑素瘤的自体TCR-T细胞治疗临床试验显示，61%NY-ESO-1阳性滑膜细胞肉瘤患者（11/18例）和55% NY-ESO-1阳性黑素瘤患者（11/20例）显示出客观临床反应。预估的滑膜细胞肉瘤患者的3年和5年总体生存率分别为38%和14%，而黑色素瘤患者相应的估计存活率均为33%[39]。

2015年，另一项TCR-T的临床试验是针对MAGE-A3的HLA-DPB1* 0401阳性的肿瘤病人。病人接受了淋巴细胞清除预处理方案，然后过继转移靶向MAGE-A3 TCR的CD4+T细胞，并伴随高剂量IL-2。在I期临床研究中，治疗了14例病人，包括最高剂量水平（78亿～1000亿细胞）的6例病人。在TCR-T 对转移性宫颈癌、食管癌和尿路上皮癌的病人的治疗中也观察到客观的部分反应，证明了表达靶向MAGE-A3的MHC II类限制性抗肿瘤TCR的自体CD4+T细胞的安全性和有效性。这是第一个用基因修饰的CD4+T细胞免疫治疗转移性癌症的临床案例[40]。

7 克服肿瘤微环境对T细胞功能的抑制

免疫细胞在肿瘤部位的遭遇是过继性细胞治疗效果决定因素之一，肿瘤的微环境不利于T细胞正常发挥功能。在肿瘤微环境中的T细胞可以被抑制，而在其他部位或外周血中类似的细胞则表现出较好的效应功能[15]。造成这种现象可能存在以下原因，包括抑制性细胞因子IL-10[41]和TGF-β[42]的存在，阻断了TGF-β信号通路；T细胞被修饰表达显性负效应的TGFβ受体等，最终可以改变TCR-T的效果。另外，T细胞上的一些抑制性因子如程序性死亡受体PD-1和CTLA-4等也可以抑制TCR-T的效果。为了克服这种抑制，目前免疫疗法联合了抗PD-1策略，如联合PD-1抗体pembrolizumab[43]。由于缺乏生长因子或共刺激因子，T细胞输注后会发生凋亡，这个问题可以通过基因工程方法修饰T细胞使其共表达抗凋亡基因如Bcl-2来 解决[44]。一些其他类型的细胞，如CD4+调节性T细胞，会抑制T细胞的免疫反应。通过去除调节性T细胞和髓源性抑制细胞可以增强细胞治疗的效果。最近也有报道发现转入MHC-Ⅰ类分子限制性的MART-1抗原特异性TCR基因的CD4+T细胞也有下调诱导型Treg细胞（iTreg）对免疫反应的抑制作用，增强CTL细胞应答的功能[45]。克服肿瘤微环境的限制也可以用干扰免疫抑制细胞或通路的小分子，例如使用IDO抑制剂很可能与工程T细胞达成协同作用。

8 结 论

在过去几年，TCR基因转移到T细胞的研究已经取得了重大的进展，随着基因细胞工程和工艺制造的进步，工程化的T细胞极大地改善了难治性癌症患者的疗效，有意义的临床应答已在黑色素瘤、结肠癌、滑膜细胞肉瘤的TCR-T细胞治疗临床试验中观察到，说明这种方法在恶性肿瘤的治疗中具有潜在的可行性。同时，也应当注意到，由于其高反应性，TCR-T细胞能够识别在任何细胞/组织中能与之结合的抗原，对正常组织产生毒副反应[46]。因此，寻找特异的肿瘤抗原，发现工程T细胞的新靶点，仍然是这一领域能够得到长期成功的一项重要任务。和其他免疫细胞疗法一样，TCR-T细胞疗法也需要克服肿瘤微环境中的免疫耐受现象，因此还有很多问题亟待解决，面临的挑战还有很多。但这种新兴的免疫细胞疗法正成为振奋人心的癌症治疗方法，特别是与TCR-T同在高速通道的CAR-T细胞治疗取得了令人鼓舞的结果，美国FDA肿瘤药物专家咨询委员会已经以10∶0的投票结果一致推荐批准诺华的CAR-T疗法CTL-019上市，CTL-019将成为全球首个获批上市的CAR-T疗法。相信伴随CTL-019治疗的成功以及治疗性T细胞工程技术水平的提高，TCR-T细胞疗法也会迅速发展，TCR-T 应用到免疫疗法和再生药物等领域将成为可能，并将成为治疗人类恶性肿瘤的希望之一。

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T cell receptor engineered T cell therapy: strategies and challenges

SHI Weixing，YANG Chunxia
Shanghai Cell-research Biotech Co., Ltd., Shanghai 200333, China

T cell receptor genetically engineered T cell therapy（TCR-T）is a very promising approach for the treatment of tumors in an adoptive cell immunotherapy. Autologous lymphocytes are transferred with tumor specific TCR gene through a variety of vectors, and then infused into patients to regress tumor cells. The current challenges of TCR-T are the identi fi cation of high af fi nity of the tumor speci fi c TCRα and β gene and optimization of the tumor speci fi c TCRα and β gene pairing to enhance the functional avidity of therapeutic T cells. In addition, based on clinical trials TCR-T can produce on-target/off-tumor toxicity by targeting antigens on normal cell surface besides on tumor. Therefore, the selection of appropriate tumor antigens is another key factor for TCR-T cell therapy in exerting its superior effect. Here, we review the expression and regulation mechanism of TCR gene, the optimization strategies of TCR pairing and other challenge issues,as well as the clinical translation and value of TCR-T in the treatment of cancer.

T cell receptor; adoptive cell immunotherapy; TCR-T; on-target/off-tumor toxicity; clinical trials

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.008