纤维素降解菌的筛选与复合菌群的构建

潘林 胡影 于天雁 王志刚

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.061[HT9.]

摘要：堆肥中的纤维素是制约堆肥进程的关键。通过对样品进行常温和高温多代驯化，获得4株高效纤维素降解菌，其中2株常温菌Bacillus amyloliquefaciens LZN01、Bacillus amyloliquefaciens LZN02，2株高温菌Bacillus licheniformis LZN03、Bacillus licheniformis MLY0。4株菌对滤纸均有降解能力，且常温菌复合菌系的滤纸崩解能力、滤纸酶活性与CMC酶活性分别为10.81%、0.17 U/mL与7.41 U/mL，高温菌复合菌系分别为5.69%、0.10 U/mL与12.69 U/mL。4株菌间不存在拮抗效应，多数能够交叉生长，能够构建成为复合菌群。因此，这4株菌在构建纤维素复合菌群并应用到堆肥体系中具有一定的前景。

关键词：纤维素；降解菌；复合菌群；堆肥

中图分类号： S182文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0229-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金项目：黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划（编号：UNPYSCT-2015092）。

作者简介：潘林（1964—），男，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，副教授，主要从事生物学方面的教学与研究工作。Tel：（0452）2738361；E-mail：plin@163.com。

通信作者：王志刚，博士，副教授，主要从事微生物学方面的教学与研究工作。Tel：（0452）2738781；E-mail：wzg1980830@sina.com。[HJ]

[ZK）]

堆肥是畜禽废弃物无害化、资源化的有效手段，但其中高含量的纤维素是制约堆肥进程的关键[1]，在堆肥过程中接种纤维素降解菌，可以有效促进纤维素的分解，加速堆肥腐熟，并提高堆肥的品质[2]。但单一菌株在堆肥中可发挥的作用有限，筛选高效纤维素降解菌株并构建高效的堆肥菌系，是处理畜禽废弃物的有效手段。构建不同功能的复合菌系可加速堆肥发酵进程，因而受到广泛关注[3-4]。因此，本试验从腐殖土和堆肥样品中分离筛选高效纤维素降解菌株，并构建高效功能性复合菌系，为堆肥腐熟剂的研发提供参考。

[BT1#]1材料与方法

1.1试剂及仪器

试剂：羧甲基纖维素钠购于天津科密欧化学试剂有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

仪器：T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；D-37520离心机（德国）；100-230V纯水系统（MILLPORE）。

1.2培养基

羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至 1 000 mL。

刚果红培养基：K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CMC-Na 1.88 g，刚果红0.2 g，明胶2 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

滤纸条培养基：KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，NaNO3 2.5 g，MgSO4 0.3 g，FeCl3 0.01 g，CaCl2 0.1 g，滤纸条（1 cm×6 cm）3条/三角瓶，蒸馏水定容至1 000 mL。

液体产酶发酵培养基：CMC-Na 7.5 g，大豆粉7.5 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·.7H2O 0.25 g，KH2PO4 4 g，滤纸2.5 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min。

1.3样品来源

从扎龙自然保护区采集的腐殖土和黑龙江田雨绿色农业工程有限公司的鸡粪堆肥中取样，并进行常温（30 ℃）及高温（50 ℃）多代驯化，筛选常温、高温菌。

1.4试验方法

1.4.1菌株的筛选与纯化

取5 g驯化后的样品与水按 1 ∶[KG-*3]10 比例混合，130 r/min振荡10 min，静置。取上清液稀释涂布于刚果红培养基上，常温菌置于30 ℃下培养；高温样品于50 ℃水浴30 min后，取上清液进行稀释涂布，50 ℃培养。挑取透明圈清晰的菌株进行分离纯化，将所得到的菌株接入滤纸条培养基中验证其对滤纸的分解情况。

1.4.2滤纸崩解试验

设置单一菌株试验组、常温混合菌与高温混合菌试验组，将各菌株组合的菌液按2%比例接入液体选择培养基中，将各菌液按照2%比例接种于100 mL滤纸条培养基中，常温菌30 ℃、130 r/min条件下振荡培养；高温菌50 ℃、130 r/min条件下振荡培养，分别于培养2、4、6、8、10 d 测定滤纸崩解情况。每个处理设置3次重复。

1.5拮抗试验

采用划线法将筛选出的纤维素降解菌在羧甲基纤维素钠培养基上进行画线，各线之间不相交，30 ℃培养24 h后观察各菌株之间的拮抗作用。

1.6不同菌株组合粗酶液制备与酶活性测定

设置单一菌株试验组、常温混合菌与高温混合菌试验组，将各菌株组合的菌液按2%比例接入液体产酶发酵培养基中，130 r/min振荡培养，每隔24 h取培养液2 mL，4 ℃，8 000 r/min 离心20 min，上清液作为粗酶液，采用3，5-二硝基水杨酸法[5]（DNS）测定酶液中还原糖含量，对照标准曲线后测定滤纸酶（FPase）活性与羧甲基纤维素酶（CMCase）活性，酶活性单位参照国际单位规定定义，即在1 mL体系中，1 min 内催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活性单位（U/mL）。endprint

1.7菌株鉴定

采用形态学、生理生化及16S rDNA序列比对进行综合鉴定，由上海美吉生物公司测序，测序结果在GenBank中进行比对，用MEGA 4.0软件进行序列比对与系统发育分析，并建立系统进化树。

1.8数据处理

采用Origin 8.5软件进行数据统计分析与图表制作。

2结果与分析

2.1菌株分离纯化与功能的初步鉴定

分离纯化得到4株纤维素降解能力较强的菌株，包含2株常温菌株（LZN01、LZN02）与2株高温菌株（LZN03、MLY01）。LZN01菌落为乳白色偏黄、圆形，边缘不规则，表面褶皱隆起，革兰氏阳性，杆状，可形成芽孢；LZN02菌落形态为白色，表面呈紧密状，干燥，革兰氏阳性，与培养基结合紧密不易挑取；LZN03、MLY01菌落为乳白色偏黄，LZN03菌落圆形，革兰氏阳性，细杆状；MLY01菌落扁平、边缘不整齐呈须根状，表面粗糙褶皱，革兰氏阳性，细长杆状。从表1可知，透明圈直径与菌落直径比值表现为LZN01>MLY01>LZN03>LZN02。透明圈直径与菌落直径的比值大小可以初步判定纤维素降解菌降解能力的大小，原则上其比值越大，对纤维素的降解能力越强。

2.2菌株16S rDNA鉴定

通过16S rDNA测序和系统进化树的同源性进行比较分析（图1）可知，LZN01与LZN02同为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），亲缘关系稍远，鉴定结果不是同一菌株；而LZN03与MLY01为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），亲缘关系较近，形态学与镜检结果不同，初步鉴定2株菌并非同一菌株。

2.3滤纸条崩解试验

由图2可知，4株菌对滤纸均有一定的降解能力，其中常温菌LZN02的降解能力较强，培养10 d时可降解19.11%的滤纸，而复合菌系可降解10.81%的滤纸；耐高温菌复合菌系降解10 d时可降解5.69%的滤纸。高温复合菌系的滤纸崩解能力高于单一菌株，说明构建高温菌复合菌系可以提高菌系的滤纸降解能力，而常温菌复合菌系的滤纸降解率低于单一菌株LZN02。

2.4常温菌滤纸酶活性与CMC酶活性

滤纸酶活性大致可以反映纤维素酶的3种酶（C1酶、Cx酶与葡萄糖糖苷酶）之间的协同作用，而CMC酶活性则仅反映纤维素酶内切β-1，4-葡聚糖的活性，酶液与底物CMC-Na的结合较强，故CMC酶活性远大于滤纸酶活性。试验结果表明，在整个培养周期内，复合菌系的滤纸酶活与CMC酶活大多高于单一菌株，复合菌系在培养6 d时有最大滤纸酶活性（0.17 U/mL） 与CMC酶活性（7.41 U/mL），但与LZN02相比，酶活增加不明显，也进一步证实LZN02可能与LZN01存在空间或营养的竞争（图3）。

2.5高温菌滤纸酶活性与CMC酶活性

由图4可知，复合菌系的滤纸酶活性在培养5 d达到最大（0.10 U/mL），酶活力稍高于单一菌株；而复合菌系的CMC酶活与单一菌株相比，变化幅度较大，在培养4 d达到最大（12.70 U/mL）。CMC酶活性变化大，说明复合菌系内切 β-1，4-葡聚糖的活性较强，并且与常温组相比，高温组2株菌均为细菌，生长速度较快且2株菌之间存在协同作用。

2.6菌株间的拮抗作用

由表2可看出，LZN01与LZN03、MLY01间无明显的拮抗作用，但不能交叉生长；LZN02与LZN01、LZN03和MLY01无拮抗可以交叉生长；LZN03和MLY01无拮抗可以交叉生长。常温菌株的最适生长温度为35 ℃，高温菌株的最适生长温度为45 ℃，结合堆肥过程中温度的变化特征，这4株菌完全具备构建符合菌群的条件。

3讨论

本试验通过对样品进行常温和高温多代驯化，得到4株高效纤维素降解菌，包括常温菌B. amyloliquefaciens LZN01、B. amyloliquefaciens LZN02，高温菌B. licheniformis LZN03、B. licheniformis MLY01。解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌是重要的生防微生物资源[6]，芽孢杆菌在自然界中的分布十分广泛，可产生多种抗菌物质且对人畜无害，对环境友好，因而备受国内外植物与环境专家的关注[7]。Bacillus amyloliquefaciens已在美国作为杀菌剂进行了登记， 用于防治土传的丝核菌和镰刀菌；可促进植物生长，并作为植物生长调节剂进行了登记；我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已开发出一批生防作用优良的枯草芽孢杆菌菌株；芽孢杆菌因具有芽孢，因此同时具有耐高温、耐酸碱等特性，在堆肥的整个时期内均为优势菌群，起着重要作用，并且芽孢杆菌也对堆体的升温有促进作用[8]。

分别对筛选得到的4株菌进行滤纸降解能力以及酶活性的测定，结果显示，供试菌株对滤纸有一定的降解能力，其中LZN02的降解能力最强。单一的细菌、真菌和放线菌尽管活性较高，但在加速堆肥化进程中的效果却不如复合微生物菌群的共同作用明显，自然界中木质素、纤维素的降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果[9]，因而复合菌系具有更高的应用价值。而酶活性测定结果显示，无论是常温复合菌系还是高温复合菌系，其CMC酶活性与单一菌株相比，变化幅度较大，而滤纸酶活性的增加则不明显，说明微生物对不同底物的降解能力和适应性存在差异，并且细菌和真菌降解纤维素的机理不同，真菌主要靠分泌多种胞外酶对纤维素进行降解，而大多数细菌的纤维素降解則是通过细胞胞外酶进行的，须要附着在纤维素表面上才能将其降解[10]。崔宗均等利用酸碱互补的原则驯化得到高效复合菌系MC1[11]。崔诗法等从枯枝落叶中分离到1组由平板可分离细菌和难培养细菌组成的纤维素分解复合菌系St-13[12]。本试验通过常温以及高温的多代驯化，得到的菌株更符合堆肥不同阶段温度特性，并且4株菌也是堆肥体系各时期均可存在的优势菌株，因此应用更为广泛。同时，本研究所构建的复合菌系只有4株菌组成，生产工序简单，质量容易控制，且均为环境友好型菌株，在实际生产应用中操作性强，应用价值较高。endprint

4结论

本试验通过对样品进行常温和高温多代驯化，得到4株高效纤维素降解菌，常温菌（LZN01、LZN02）为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），高温菌（LZN03、MLY01）为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。高温菌复合菌系的滤纸崩解能力在培养5 d时高于单一菌株，且各菌株间不存在拮抗效应，因此，这几株菌在构建纤维素复合菌群方面具有广泛的应用前景。

[HS2]参考文献：[HJ1.72mm]

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