以小麦为基质的灵芝固体发酵条件研究

杨宗渠 李长看 雷志华 李玉华 曲金柱 高红云 罗青

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.043[HT9.]

摘要：为筛选灵芝菌丝体生长的适宜环境条件和基质，以台湾灵芝和赤芝为材料，观察菌丝体在不同温度、pH值、氮源、光照条件、基质下的生长情况。结果表明：台湾灵芝的最适生长温度为25 ℃，培养基最适初始pH值为5.0，最适氮源为（NH4）2SO4，在黑暗中生长最好；赤芝的最适生长温度为30 ℃，培养基最适初始pH值为5.5，最适氮源为牛肉膏；台湾灵芝和赤芝菌丝体均在小麦80%、谷子10%、荞麦10%配方培养基质上生长最旺盛。

关键词：灵芝；菌丝体；培养条件；小麦

中图分类号： S188+.4文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0150-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-08-15

基金项目：河南省重点科技攻关项目（编号：102102110182）。

作者简介：杨宗渠（1964—），男，河南延津人，博士，教授，研究方向为生物资源利用与转化。E-mail：yangzqu@163.com。

[ZK）]

灵芝是我国传统的食药兼用真菌，是自然界珍稀的菌类。迄今为止，人们已经从灵芝中分离出150种化合物，如多糖、腺苷、有机锗、三萜等[1]。野生的灵芝子实体资源少，加之不合理采挖，导致药源不足。灵芝子实体栽培要消耗大量木材，破坏森林资源，且灵芝子实体生产周期长、受气候条件影响较大、产量低而不稳。研究证实，发酵菌丝体与子实体成分一致[2]，为利用发酵工程技术生产灵芝菌丝体提供了理论基础。固体发酵生产灵芝菌丝体与子实体栽培相比，具有难度低、生产周期短、次生代谢产物积累时间长、培养料来源广泛等优点。魏龙等研究了接种量、料层厚度、初始酸碱度、发酵时间对灵芝固体发酵产物抗氧化活性的影响[3]。张平等采用灵芝菌丝固体发酵枇杷叶，分析发酵前后枇杷叶中主要活性成分的变化[4]。曲墨等报道了以中药渣和莲藕渣为基质的灵芝菌固体发酵条件[5-6]。杜亚楠等在大豆固体培养基中接种富硒灵芝菌种，探索固体发酵生产游离氨基酸的工艺条件[7]。付铭等以多糖及赖氨酸含量为指标，研究不同大米加量、装液量、培养基酸碱度和培养温度对灵芝菌丝体生长的影响[8]。笔者以小麦为发酵基质，以菌丝生长速度为指标，研究不同菌株菌丝的生长特性，探索以小麦为基质的灵芝固体发酵条件，旨在为将灵芝固体发酵技术应用于小麦深加工提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

供试菌株台湾灵芝从中国科学院微生物研究所引进，赤芝由中华供销合作总社昆明食用菌研究所提供。CP313型电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；DH-420型电热恒温培养箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；LRH-300-G型光照培养箱（广东省医疗器械厂）；立式高压灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；PHSJ-5型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）。

1.2方法

1.2.1培养基

母种采用PDA加富培养基。固体培养基以小麦为主要原料，添加辅料制成培养基质。称取一定量的小麦、燕麦、玉米、荞麦、谷子、糙米、高粱，用凉水浸泡，放置冰箱12 h后煮沸，煮熟但不裂开，放凉至不黏手，按比例配制培养基质。

1.2.2试验设计

设置20、25、30、35、40 ℃等5个温度处理。将灵芝菌种接种到PDA平板加富培养基上，分别置于5种温度的恒温培养箱中培养，每个温度处理台湾灵芝、赤芝各接种4个培养皿。

设置4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等7个pH值。采用10% NaOH或10% HCl将PDA加富培养基分别调整为不同酸碱度，每个pH值下台湾灵芝、赤芝各接种4个培养皿，放于最适温度下的恒温培养箱中培养。

设置奶粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4 4个处理。在PDA加富培养基中分别添加2%的不同氮源，每个处理接种4个培养皿，在最适温度下的恒温培养箱中培养。

设置光照、黑暗条件2个处理。将菌种接种到加富PDA培养基上，分别置于黑暗和12 h光照的恒温培养箱，在最适温度下培养。每个處理接种4个培养皿。

培养期间定期观察菌丝体生长情况，测量菌落直径。

以小麦为主要原料，添加不同比例的其他谷物，制成5种培养基质：A：小麦80%、谷子10%、荞麦10%；B：小麦70%、玉米20%、糙米10%；C：小麦70%、高粱20%、薏米10%；D：小麦60%、燕麦20%、籼米20%；E：小麦100%。将培养基质装入500 mL菌种瓶，棉塞封口，121 ℃灭菌2.5 h。每个菌株在每种培养基质上接种6瓶，置于25 ℃恒温培养箱中培养，培养3 d后摇动菌种瓶。观察灵芝菌丝的生长情况，并记录菌丝体长势及长满瓶的天数。

2结果与分析

2.1温度对灵芝菌丝体生长的影响

从表1可以看出，9 d内，台湾灵芝的菌落直径均以25 ℃最大，30 ℃次之，20、35 ℃下菌落直径较小，40 ℃下菌丝未生长。赤芝则是30 ℃下菌落直径最大，其次分别是25、35 ℃，20 ℃菌落直径最小，40 ℃下菌丝未生长。由此可知，台湾灵芝的最适生长温度为25 ℃，赤芝在30 ℃下生长最快。20、25 ℃ 下台湾灵芝菌丝生长速度比赤芝快，台湾灵芝菌丝洁白，赤芝菌丝稍微发黄；30、35 ℃下赤芝菌丝生长速度比台湾灵芝快，且赤芝菌丝发黄。

2.2培养基酸碱度对灵芝菌丝体生长的影响

从表2可知，2个灵芝菌株的菌丝在pH值4.5～7.5之间的培养基上均能生长。台湾灵芝在pH值5.0～6.0之间培养基上的菌落直径大于pH 值5.0以下或6.0以上的培养基，pH值为5.0时菌落直径最大，且菌丝浓密，长势旺盛，说明台湾灵芝菌丝体生长的最适pH值为5.0。赤芝菌丝在同一pH值的培养基上菌落直径大于台湾灵芝，pH值为5.5时赤芝菌落直径最大，长势好，菌丝洁白、浓密，说明赤芝菌丝生长的最适pH值为5.5。endprint

2.3氮源对灵芝菌丝体生长的影响

由表3可知，氮源对台湾灵芝菌丝生长有显著影响，在含有（NH4）2SO4的培养基上生长最好，菌落直径最大，生长旺盛，菌丝浓密，牛肉膏、蛋白胨次之，以奶粉作为氮源时菌落直径最小。由此可知，台湾灵芝菌丝对无机氮源（NH4）2SO4的利用能力较强。赤芝菌丝的菌落直径在牛肉膏为氮源的培养基最大，其次为（NH4）2SO4，奶粉、蛋白胨较小，说明赤芝菌丝生长的最适氮源为牛肉膏，赤芝对奶粉、蛋白胨的利用能力较弱。在相同氮源下，赤芝菌丝的菌落直径均大于台湾灵芝，说明赤芝对氮源的适应能力强于台湾灵芝。

2.4光照对灵芝菌丝体生长的影响

由表4可知，2个供试菌株的菌丝在黑暗条件下的菌落直径均大于光照条件下，且黑暗条件下，菌丝长势旺盛，浓密、洁白；光照条件下，菌丝稀疏、长势弱。说明2个供试菌株的菌丝均适宜在黑暗环境中生长。光照条件下，赤芝菌丝体生长速度较台湾灵芝缓慢，黑暗条件下，赤芝菌丝体的生长速度明显快于台湾灵芝。可见，与台湾灵芝相比，赤芝菌丝体生长对光照条件更为敏感。

2.5基质成分对灵芝菌丝生长的影响

分别在5种配方的固体培养基上接种台湾灵芝和赤芝，黑暗条件下培养，观察菌丝生长情况，结果如表5所示。台湾灵芝在A培养基上生长速度最快、长势强，B培养基次之，D、E培养基上菌丝生长速度最慢、长势弱。赤芝菌株在整个培养过程中菌丝泛黄，A基质上的菌丝生长速度最快，且菌丝浓密，B基质上菌丝生长最慢，菌丝较稀疏，C、D、E基质上菌丝生长速度相差不大，C基质上菌丝较D、E基质上浓密。由此可知，台湾灵芝、赤芝的最适培养基配方均为A基质。

3结论与讨论

温度是影响灵芝菌丝体生长的重要因子之一。杜曾荣等报道，黑灵芝（Ganoderma atrum）菌丝体最适生长温度为 33 ℃[9]。杨德等[10]、谭才邓等[11]、余有贵等[12]研究均发现，赤灵芝菌丝体的最适生长温度为27 ℃。本研究中，台湾灵芝、赤芝菌丝的最适生长温度分别为25、30 ℃，与上述报道不一致，其原因是试验菌株不同、菌株的生长特性差异所致。培养基酸碱度通过影响细胞膜的通透性和营养物质的溶解度来影响营养物质的吸收，从而影响灵芝菌丝的生长。灵芝菌丝体生长适宜的pH值大多在5.5～6.5，培养基的初始pH值应提高，因为培养基在灭菌后pH值会降低，同时菌丝体在生长过程中会产生有机酸而使pH值减小[13]。本研究中，台湾灵芝培养基最适初始pH值为5.0，赤芝最适初始pH值则为 5.5，据此认为，菌丝体生长中产生的有机酸和灭菌过程对培养基pH值影响很小，应将固体发酵基质初始pH值调整到 5.0～5.5。2个菌株的菌丝体在光照条件下生长受到不同程度的抑制，与前人报道[10，12]一致。

灵芝菌丝体对氮源的适应能力较强，但对不同种类氮源的利用能力不同。与现有报道[13]不同，本研究中，台湾灵芝利用无机氮（NH4）2SO4的能力大于蛋白胨、牛肉膏、奶粉等有机氮，赤芝利用（NH4）2SO4的能力大于蛋白胨和奶粉，其原因可能是2个菌株菌丝体分泌的催化无机氮合成某些必需氨基酸的酶类活性较强，但其机理还有待进一步研究。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、膳食纤维、矿物质、钙、铁、维生素等成分，可为灵芝菌丝体生长提供必需的碳源、氮源、微量元素、微量活性物质，2个菌株的菌丝体在以小麦为主要原料的培养基上生长良好，说明小麦作为灵芝固体发酵基质是适宜的。由于灵芝固体发酵是以获得灵芝多糖等功能成分为目的，所以还需进一步研究培养条件对菌质中灵芝多糖含量的影响。同时，发酵过程中菌丝分泌的酶类会催化淀粉、蛋白质等营养成分的水解，灵芝固体发酵菌质中营养成分的变化也需要进行深入研究。

[HTK]致谢：郑州师范学院生命科学学院生物科学专业学生杨晶晶、王利红、刘旭、孟翠、李岩参加部分研究工作，在此表示感谢！[HT]

[HS2]参考文献：

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