刺槐花总黄酮超声辅助提取工艺优化及抗氧化性评价

周林宗+张伦+杨申明+王振吉+罗亚仙

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.042[HT9.]

摘要：以刺槐花为材料，优化超声波辅助提取总黄酮的工艺，并测定其总黄酮的抗氧化性。在单因素试验的基础上，以总黄酮提取率为指标，通过正交试验优化其总黄酮的提取工艺参数，并通过刺槐花总黄酮对1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的清除来评价其抗氧化能力。结果表明，最佳提取工艺参数为：超声温度45 ℃、超声时间70 min、料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、乙醇体积分数70%，在该条件下总黄酮平均提取率为28.69%，RSD值为0.72%；总黄酮质量浓度为0.47 mg/mL时，对DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率分别达到88.04%、34.41%、59.07%，表明刺槐花总黄酮具有较强的抗氧化性。

关键词：刺槐花；超声辅助提取；总黄酮；抗氧化性

中图分类号： R284.2文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0146-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-06

基金项目：国家自然科学基金（编号：31300370）；云南省高校科技创新团队支持计划（编号：IRTSTYN）；云南省应用基础研究项目（编号：2014FD052）；楚雄師范学院学术骨干项目（编号：13XJGG03）；楚雄师范学院教改项目（编号：1510）。

作者简介：周林宗（1962—），男，云南楚雄人，副教授，从事天然产物化学研究及教学工作。E-mail：ysm@cxtc.edu.cn。

通信作者：张伦，博士，讲师，研究方向为天然产物化学。E-mail：cxzhanglun@cxtc.edu.cn。

[ZK）]

刺槐（Robinia pseudoacacia L.）别称洋槐，为豆科蝶形花亚科刺槐属多年生落叶乔木或灌木[1]。刺槐产花量较大，花中含有丰富的蛋白质、氨基酸、微量元素、黄酮类化合物和挥发油等，花可炒食作野菜食用，也可入药使用，具有较高的食用价值和药用价值[2]。在民间，刺槐花用于治疗大肠下血、咯血、吐血、妇女红崩等病症。我国刺槐花资源丰富，但其利用率低，除少量被食用和药用外，大部分刺槐花落地荒弃。因此，从刺槐花中提取有效成分并对其进行开发利用具有重要意义。

目前，对刺槐花的研究主要集中在成分分析[2-4]、药理作用[5-6]、食品加工[7-9]等方面。近年来，对刺槐花中黄酮类化合物的研究正引起有关学者的高度关注。王岚等采用高效液相色谱-质谱联用技术分析法从刺槐花中鉴定出11种黄酮苷[10]，李艳艳等采用乙醇回流法对刺槐花总黄酮的提取工艺进行了研究[11]，向昌国等采用响应面法对刺槐花黄酮类化合物的微波提取工艺进行了研究[12]，但采用超声波辅助提取刺槐花总黄酮的工艺化化及抗氧化性研究鲜见报道。本试验以刺槐花为材料，采用超声辅助从刺槐花中提取总黄酮，通过正交试验对提取工艺条件进行优化。同时，以维生素C为对照，并对所提取的总黄酮从清除1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的能力3个方面评价其抗氧化性，旨在为更好地开发和利用刺槐花中黄酮类物质提供科学依据和参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

刺槐花采自楚雄师范学院校园内，经鉴定为豆科蝶形花亚科刺槐属植物；芸香苷标准品（HPLC﹥98%）由中国药品生物制品检定所生产，1，1-苯基-2-苦肼基自由基由上海蓝季科技发展有限公司生产，其他所用化学试剂均为分析纯，由天津市风船化学试剂厂生产。

1.2仪器与设备

α-1502紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；SHZ-Ⅲ A型循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；SK8210HP型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；HWS-26型电热恒温水浴锅，江苏省金坛市大地自动化仪器厂；CP224C型电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；DG-111型电热干燥箱，威瑞科教仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1刺槐花总黄酮的提取

将新鲜刺槐花洗净风干后置于55 ℃干燥箱中烘干，粉碎后过60目得刺槐花干粉，备用。准确称取1.0 g刺槐花干粉，加入一定体积分数的乙醇，设定一定超声温度，水浴一定时间，其间进行超声波（功率 500 W）辅助提取，提取完毕后，将提取液减压抽滤，收集滤液，所得滤渣再次用上述方法提取，合并2次滤液定容至 50 mL 容量瓶中，得供试品溶液。

1.3.2总黄酮含量的测定

1.3.2.1标准曲线的制备

参考文献[13]的方法，稍作修改。精确吸取0、1、2、3、4、5 mL质量浓度为0.10 mg/mL芸香苷标准溶液，分别置于25 mL比色管中，各加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀；放置5 min后，各加入10%硝酸铝溶液 1.0 mL，摇匀；放置5 min后，再各加入4%氢氧化钠溶液 5.0 mL，最后用体积分数为70%的乙醇溶液稀释至25 mL，摇匀，放置10 min。以蒸馏水为空白对照，在波长510 nm处分别测其吸光度。以吸光度为纵坐标、芸香苷质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程，为D=1.073C+0.573 5。式中：D为吸光度；C为葡萄糖标准溶液浓度，mg/mL；相关系数 r2=0.999 77。

1.3.2.2总黄酮提取率的计算

准确吸取2.0 mL供试品溶液于25 mL的比色管中，按“1.3.2.1”节标准曲线的制备操作方法，在波长510 nm处测定吸光度，平行测定3次，结果取平均值。刺槐花总黄酮的提取率计算公式为：endprint

[JZ]总黄酮提取率=[SX（]C×N×V×0.001m[SX）]×100%。

式中：C为所测溶液的吸光度值带入回归方程计算出的总黄酮类化合物的质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为提取液定容的体积，mL；m为刺槐花粉末的质量，g。

1.3.3单因素试验设计

考察超声温度、时间、液料比和乙醇体积分数等4个单因素的影响。（1）超声温度采用40、45、50、55、60 ℃的条件下进行比较，超声时间60 min，料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇体积分数70%；（2）超声时间采用40、50、60、70、80 min的条件下进行比较，超声温度50 ℃，料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇体积分数70%；（3）料液比采用1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]25、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]35、1 ∶[KG-*3]40（g ∶[KG-*3]mL） 的条件下进行比较，超声温度50 ℃，超声时间60 min，乙醇体积分数70%；（4）乙醇体积分数采用50%、60%、70%、80%、90%的条件下进行比较，超声温度50 ℃，超声时间60 min，料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL，从而确定乙醇体积分数的影响作用。

1.3.4正交试验设计

根据单因素试验结果，选择超声温度、超声时间、料液比、乙醇体积分数进行4因素3水平做 L9（34） 正交试验优化提取条件，因素水平设计见表1。

1.3.5刺槐花总黄酮抗氧化活性测定

将超声波辅助提取得到的刺槐花总黄酮溶液分别配制成0.03、0.14、0.25、0.36、0.47 mg/mL等5种不同质量浓度，研究其抗氧化性。

1.3.5.1清除DPPH·能力测定参照文献[14]的方法测定刺槐花总黄酮溶液对DPPH·的清除能力。向2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中分别加1 mL不同质量浓度的刺槐花总黄酮溶液，混合反应30 min，在波长517 nm处用分光光度计测吸光度，记为Di；同时测2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液与1.0 mL无水乙醇混合液的吸光度（Dc），及2.5 mL无水乙醇与不同质量浓度的1 mL刺槐花总黄酮溶液混合液的吸光度（Db）。以维生素C为阳性对照，刺槐花总黄酮对DPPH·清除率计算公式为：

[JZ]DPPH·清除率=（1-[SX（]Di-DbDc[SX）]）×100%。

1.3.5.2清除·OH能力測定参照文献[15]的方法测定刺槐花总黄酮对·OH的清除能力。取1.0 mL不同质量浓度的刺槐花总黄酮溶液置于5支比色管中，分别加入 9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmoL/L水杨酸-乙醇溶液和 8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，最后加蒸馏水定容至 10 mL，在37 ℃恒温水浴中反应30 min后，在波长510 nm处用分光光度计测吸光度。同时，以维生素C为阳性对照，刺槐花总黄酮对·OH清除率，计算公式为：

[JZ]·OH清除率=[SX（]D0-（DX-DX0）D0[SX）]×100%。

式中：D0为刺槐花总黄酮溶液的空白对照溶液的吸光度；DX为加过氧化氢刺槐花总黄酮溶液的吸光度；DX0为不加过氧化刺槐花总黄酮溶液的吸光度。

1.3.5.3清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]能力测定参照文献[13]的方法测定刺槐花总黄酮溶液对 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除能力。在5支25 mL比色管中加入不同质量浓度的刺槐花总黄酮溶液1.0 mL，再依次加入4.5 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH值=8.2）、3.2 mL超纯水，混匀后在25 ℃水浴中恒温反应20 min，取出后迅速加入25 ℃水浴中预热好的0.3 mL邻苯三酚溶液（3 mmol/L），以0.3 mL盐酸（10 mmol/L）代替作参比，混匀后迅速在波长325 nm处每隔30 s测1次吸光度，直到5 min时停止。计算刺槐花总黄酮溶液的吸光度随时间的变化率，记为Fx；取1支25 mL比色管不加刺槐花总黄酮溶液，按上述加入试剂量后，按上述方法测定吸光度，计算空白液的吸光度随时间的变化率记为F0。同时，以维生素C为阳性对照，刺槐花总黄酮对 O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率计算公式为：

[JZ] O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率=[SX（]F0-FXFX[SX）]×100%。

2结果与分析

2.1超声温度对刺槐花总黄酮提取效果的影响

由图1-a可知，在超声温度为40～50 ℃范围内，随着超声温度的升高，总黄酮提取率增大，当超声温度升高到50 ℃时，提取率达到最大，为27.98%；之后随超声温度的继续升高，刺槐花总黄酮提取率呈下降趋势。这可能是随着超声温度的升高，总黄酮在乙醇溶液中的溶解度增加，同时由于温度升高，分子运动加快，扩散速率增加，促使提取速度加快[16]。但超声提取温度过高，会破坏部分黄酮类化合物结构并增加其他非黄酮类物质溶出，影响黄酮类物质的活性和提取率。因此，确定适宜的超声温度在50 ℃附近，选择45、50、55 ℃等3个水平超声温度进行正交试验。

2.2超声时间对刺槐花总黄酮提取效果的影响

由图1-b可知，随着超声时间的延长，刺槐花总黄酮提取率逐步增大，当超声时间为60 min时，提取率达到最大，为27.93%；之后再延长超声时间，刺槐花总黄酮提取率呈下降趋势。这说明刺槐花总黄酮的提取过程与超声时间密切相关，超声时间较短，提取不充分，超声时间过长又会造成刺槐花中非黄酮类物质的大量溶出，导致提取率下降。因此，确定适宜的超声时间在60 min附近，选取超声时间50、60、70 min等3个水平进行正交试验。endprint

2.3料液比对刺槐花总黄酮提取效果的影响

由图1-c可知，随着溶剂用量的增加，刺槐花中总黄酮提取率增大，但随着溶剂用量的进一步增加，对提取率增加的效果逐步减小，同时提取成本进一步增大，当料液比为 1 g ∶[KG-*3]30 mL时，提取率达到最大，为27.48%；之后随着溶剂用量的进一步增大，刺槐花總黄酮提取率呈下降趋势。因此，确定适宜的料液比在1 g ∶[KG-*3]30 mL附近，选取料液比 1 ∶[KG-*3]25、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]35（g ∶[KG-*3]mL） 3个水平进行正交试验。

2.4乙醇体积分数对刺槐花总黄酮提取效果的影响

由图1-d分析可知，在乙醇体积分数为50%～70%范围内，总黄酮提取率随乙醇体积分数的增大而增大，当乙醇体积分数为70%时，提取率达到最大（27.86%），之后随乙醇体积分数的继续增大，提取率呈下降趋势。这可能是在低浓度乙醇下，随着乙醇体积分数的逐渐增大，醇溶性物质的溶出量增加，提取率开始呈现增大的趋势；但随着乙醇体积分数的进一步增大，刺槐花中的一些醇溶性和脂溶性的杂质溶出量也逐渐增多，这些成分可能会与乙醇—水分子体系结合，与黄酮类化合物形成竞争，影响刺槐花黄酮类物质的溶出，导致总黄酮提取率下降[17]。因此，确定适宜的乙醇体积分数在70%附近，选取乙醇体积分数60%、70%、80%等3个水平进行正交试验。

2.5正交试验结果

从表2分析可知，对刺槐花总黄酮提取率的影响因素由大到小为超声温度>乙醇体积分数>料液比>超声时间。由极差分析得到最佳提取工艺组合为A1B3C2D2，即超声温度 45 ℃、超声时间70 min、料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、乙醇体积分数70%。由于正交试验中没有出现最佳工艺组合，因此在优化后的最佳工艺组合条件下进行验证性试验，重复5次，得到刺槐花总黄酮平均提取率为28.69%，相对标准偏差（RSD）值为0.72%，大于正交试验中最高提取率28.15%。结果表明，优化后的提取工艺重复性良好，试验数据可靠。因此，本试验优化后得到的提取工艺可用于刺槐花中总黄酮的提取。

2.6刺槐花总黄酮清除DPPH·的能力评价

DPPH是一种以氮为中心的稳定自由基，其乙醇溶液在波长517 nm处有强吸收峰，当待测溶液中含有抗氧化物时，抗氧化物能使DPPH的特征紫色变浅或消失，且DPPH特征紫色褪色程度与抗氧化剂的抗氧化能力呈正相关[18]。因此，可根据DPPH溶液褪色程度来评价其抗氧化剂的抗氧化能力。从图2-a可以看出，随刺槐花总黄酮质量浓度的增大，清除DPPH·的能力逐步增强，即清除率与刺槐花总黄酮质量浓度间有量效关系。在所试质量0.03～0.47 mg/mL范围内，当总黄酮质量浓度为0.47 mg/mL时，DPPH·的清除率达到最大（88.04%）。虽然刺槐花总黄酮清除DPPH·的能力稍弱于维生素C清除DPPH·的能力，但刺槐花总黄酮仍然表现出较强的清除DPPH·的能力，表明所提取的刺槐花总黄酮具有较好的抗氧化能力。

[FK（W15][HT6H][JZ]表2对刺槐花总黄酮提取率的影响因素正交试验结果[HTSS][STBZ]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK3，WK4。3，WK5*2，WK8*2W]试验序号A：超声温度B：超声时间C：料液比D：乙醇体积分数总黄酮提取率（%）2.7刺槐花总黄酮清除·OH的能力评价

H2O2与FeSO4反应会产生·OH，·OH具有较强的氧化能力，通过攻击水杨酸分子中的苯环使其发生氧化反应，生成的有色物质在波长510 nm处的吸光度与·OH的生成量成正比[19]。若反应体系中加入抗氧化剂，·OH受到抑制，使有色物质生成量减少，可用清除·OH的能力来评价抗氧化物的抗氧化性。从图2-b可以看出，刺槐花总黄酮对由H2O2/[FL）]

[FK（W12][TPZLZ2.tif][FK）]

[FL（2K2]

Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH具有清除作用，且随刺槐花总黄酮质量浓度的增大，其清除·OH的能力逐步增强，即清除率与总黄酮的浓度间有量效关系。在所试质量浓度0.03～0.47 mg/mL范围内，当总黄酮质量浓度为 0.47 mg/mL 时，·OH的清除率达到最大，为34.41%。虽然刺槐花总黄酮清除·OH的能力远远弱于维生素C清除 ·OH 的能力，但刺槐花总黄酮也表现出一定的清除·OH的能力。

2.8刺槐花总黄酮清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力评价

O-2[KG-*2]· [KG-*3]可通过邻苯三酚在弱碱介质中自氧化产生，并生成有色中间产物，总黄酮能够抑制 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的形成，通过在波长 325 nm 处测定有色中间产物的生成量，可测定总黄酮的清除能力。总黄酮能够与 O-2[KG-*2]· [KG-*3]结合形成稳态自由基，终止自由基链反应，而发挥抗氧化作用[20]。从图2-c可以看出，刺槐花总黄酮在所试质量浓度0.03～0.47 mg/mL范围内，随质量浓度的增大，清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力增强，当总黄酮质量浓度为047 mg/mL时， O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率达到最大，为59.07%。与同质量浓度维生素C相比，刺槐花总黄酮清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力弱于维生素C清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力，但刺槐花总黄酮依然表现出较强的清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力。

3结论与讨论

超声波辅助提取刺槐花总黄酮中，影响总黄酮提取效果的因素主次为超声温度>乙醇体积分数>料液比>超声时间。经过正交试验优化后得到的最佳提取工艺参数为：超声温度45 ℃，超声时间70 min，料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇体积分数70%。在该条件下进行验证性试验，重复5次，得到刺槐花总黄酮平均提取率为28.69%，RSD值为 0.72%。该优化后的提取工艺具有提取率高、重复性好等优点，可用于刺槐花总黄酮的提取。endprint

抗氧化性试验结果表明，刺槐花总黄酮质量浓度在 0.03～0.47 mg/mL范围内，随着刺槐花总黄酮质量浓度的增大，清除DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力逐步增强，且刺槐花总黄酮质量浓度与清除率呈量效关系。当刺槐花总黄酮质量浓度为0.47 mg/mL时，对DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率分别为88.04%、34.41%、59.07%。虽然与同质量浓度的维生素C相比，清除DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力弱于维生素C，但刺槐花总黄酮仍然表现出较强的清除DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力，说明刺槐花总黄酮具有较强的抗氧化活性。

本研究结果表明，超声辅助提取刺槐花总黄酮具有提取率高、重复性好等优点，是一种较为理想的提取方法。超声辅助提取得到的刺槐花总黄酮具有较强的抗氧化性，相关试验结果为刺槐花总黄酮的提取和抗氧化的研究提供了科学依据和参考。但本试验仅对超声波辅助提取的刺槐花总黄酮进行体外抗氧化活性研究，而对体内抗氧化性未进行相关研究，今后要在本试验的基础上，对超声辅助提取的刺槐花总黄酮进行体内抗氧性研究，为开发安全无毒的天然抗氧化剂提供科学的依据和参考。

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