猪瘟病毒强毒株SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

张永英+马腾壑+刘彦威+王慧真+朱美霞

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.040[HT9.]

摘要：为准确快速诊断猪瘟病毒（classical swine fever virus，简称CSFV）强毒，对GenBank已公布的CSFV 的基因组全序列进行分析，根据CSFV-5′NTR核苷酸序列设计1对特异的荧光定量引物，建立快速检测猪瘟病毒强毒株SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果表明，该法具有很好的敏感性，对猪瘟病毒最低检出量为10拷 贝/μL；特异性强，与猪瘟兔化弱毒苗、伪狂犬病毒（简称PRV）、猪细小病毒（简称 PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（简称PRRSV）、圆环病毒组织苗（简称PCV2）没有交叉反应；重复性好，变异系数（CV）为0.47%～1.36%。该方法可用于猪瘟病毒的快速检测。

关键词：猪瘟病毒；强毒株；SYBR GreenⅠ；定量PCR

中图分类号： S852.65+1文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0142-02[HS）][HT9.SS]

[HJ1.2mm]

收稿日期：2016-03-15

基金项目：河北省邯郸市科技局资助项目（编号：1422101047）。

作者简介：张永英（1972—），女，河北衡水人，硕士，副教授，主要从事动物疾病防控研究。E-mail：1626074123@qq.com。[HJ]

[ZK）]

猪瘟（简称CSF），是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，简称CSFV） 引起的猪的一种热性、致死性、高度接触性传染病，是一种对猪危害性极大的传染病[1]。目前我国将其定为一类传染病，且已纳入国家强制免疫计划[2]。CSFV是单股正链RNA病毒，基因组大小约为12.3 kb。我国CSFV野毒株均属于基因Ⅱ群，而C株属于基因Ⅰ群，由于C株疫苗的广泛使用，即使在实验室检测CSFV野毒感染时，也难以将两者区分开。而且CSFV和牛病毒性腹泻病（简称BVDV）、绵羊边界病毒（简称BDV）同属，均能引起猪的感染，且存在血清学交叉反应，给CSF的鉴别诊断带来了困难。因此，建立一种快捷、准确、灵敏的诊断方法，对有效控制和扑灭猪瘟是非常有必要的。

1材料与方法

1.1试验材料

CSFV石门系强毒株、HCV兔化弱毒苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒（简称PRRSV）、猪细小病毒灭活苗（简称PPV）、伪狂犬病毒灭活苗（简称PRV）、圆环病毒组织苗（简称PCV2）。由河北工程大学农学院预防实验室保存并提供。

SYBR Premi Ex Taq、Taq DNA 聚合酶、pMD18-T载体等均购自宝生物工程（大连）有限公司。小量质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。仪器主要有Bio-RAD Mini荧光定量PCR仪。

1.2引物的设计与合成

参照GenBank中公布的25株CSFV基因组进行比较分析，采用Primer Experss2.0软件设计了1对特异性引物，上游引物为P1：5′-TTGGCATCATTGCATAAGGG-3′，下游引物为P2：5′-GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3′。引物由北京华大基因科技服务有限公司合成。

1.3病毒基因组总RNA的提取

参照Trizol试剂使用说明书提取样品总RNA。

1.4反转录cDNA的合成

参照反转录酶 M-MuLV使用说明书合成 cDNA，反应产物于-20 ℃保存。20 μL反应体系：4 μL模板RNA、2 μL特异性引物P2 、6 μL DEPC水、4 μL 5×buffer、1 μL M-MuLV（200 U/μL）、1 μL RNA抑制剂、2 μL dNTPs，42 ℃水浴 90 min，70 ℃水浴10 min。

1.5标准品的制备

[JP2]反应结束后取cDNA产物进行电泳鉴定。回收大小为 548 bp 的目的条带，纯化后连接pMD18-T载体、转化大肠杆菌，经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组菌按试剂盒说明提取其DNA，D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0的阳性重组质粒用于绘制标准曲线。根据D260 nm值计算质粒浓度并换算成拷贝数，然后10倍稀释成1.0×109～1.0×101拷贝/μL 9个梯度，分别以9个稀释度为模板进行SYBR Green Ⅰ定量PCR检测。并且判定在40个循环内出现特异性扩增曲线的最低拷贝数。[JP]

1.6SYBR GreenⅠ定量PCR标准曲线的绘制

采用25 μL反應体系：SYBR Premix ExTaq（2×）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1.0 μL，用双蒸水补足至25 μL。反应程序：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后，采用软件制作熔解曲线。当荧光定量PCR检测结果有S形扩增曲线，判定待测样品为阳性；如为一条直线，则判定样品为阴性。

1.7敏感性试验

[JP3]将阳性模板从1.0×109～1.0×101经10倍系列稀释的9个浓度梯度，各梯度稀释液分别取1 μL作为模板，测定其敏感性。[JP]

1.8特异性试验

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR扩增猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株、石门强毒株、PRRSV、PCV2、PRV、PPV基因组。

1.9重复性试验

将cDNA进行10倍系列稀释，选3个稀释度，每个稀释度进行3次平行试验，用SYBR GreenⅠ定量PCR检测，根据CT值差异计算组内变异系数（CV）。endprint

2結果与分析

2.1SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR确定病毒的Tm值

以石门毒株cDNA为模板，进行SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR，结果见图1。判定标准：动力学曲线呈现指数扩增，阴性对照无扩增，Tm在83.5～84.5 ℃出现特异荧光信号时，判定为石门毒株（图1）。

2.2荧光定量PCR标准曲线的建立

通过优化荧光定量PCR反应条件和体系，绘制检测猪瘟病毒的标准曲线（图2）。结果显示，石门病毒荧光定量PCR标准品浓度从109～101拷贝/μL具有很好的线性关系。

2.3特异性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法对猪瘟兔化弱毒苗、PRV、PPV、PRRSV、PCV2、CSFV进行检测。结果显示，根据判定标准，除CSFV为阳性外，其他检测结果均为阴性（图3）。

2.4敏感性试验

利用石门病毒实时荧光定量PCR方法能检测到最低极限浓度为10个拷贝/μL。

2.4重复性试验

从表1可以看出，各浓度梯度CT变异系数在0.47%～1.36%之间。提示该定量PCR方法稳定，重复性较好。

3结论与讨论

SYBR Green Ⅰ染料实时荧光定量PCR法在核酸检测方面与血清抗体中和试验、间接ELISA等方法相比较，在敏感性、特异性、耗时等方面有许多优点，且能区分病毒株和疫苗株。SYBR Green Ⅰ与所有的双链DNA 相结合，不需要特别定制，通用性好，而且它不需要用到对人体有致癌危害的EB[3-4]。但是该方法易受引物二聚体或非特异性扩增产物干扰，对引物要求高[5-6]。为确保试验，严格按定量PCR要求设计1对特异性引物，经过反应体系优化，熔解曲线测试和凝胶电泳验证，结果显示，熔解曲线为单一波峰，Tm值均一；凝胶电泳显示，目的条带都在同一位置，并无杂带干扰。因此，证实该引物设计和反应体系完全符合试验要求。

经过阳性模板稀释检测证明，本试验可以检测到1×101 拷贝/μL的病毒模板，灵敏度较高。在特异性试验中该方法与PRRSV、PPV、PRV、 PCV2、猪瘟兔化弱毒苗不存在交叉反应，说明该方法特异性强。本研究建立了猪瘟强毒株SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法，为猪瘟病毒早期诊断奠定了基础，提供了防控猪瘟的有效技术手段。

[HS2]参考文献：[HJ1.3mm]

[1][ZK（#]Stegeman A，Elbers A，de Smit H，et al . The 1997—1998 epidemic of classical swine fever in the Netherlands[J]. Veterinary Microbiology，2000，73（2/3）：183-196.

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