怀地黄内生细菌的分离鉴定及抗菌活性

王瑞飞+康春晓+许圆圆+杨清香

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.023[HT9.]

摘要：从药用植物怀地黄的根中分离出32株内生细菌，并选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、地黄斑枯病和地黄根腐病5种菌作为供试菌株，采用点菌法、平板对峙法和菌饼法测定抗菌活性。结果显示，怀地黄中分离的32株内生菌对5种供试菌具有不同的抑制能力，其中有8株细菌对供试的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉都有抑制作用，显示出广谱的抗菌性；有2株细菌DH-10和DH-11对选取的5种供试菌都有抑制作用，且抗菌活性较强，具有生防菌开发潜力。所分离的活性内生菌通过16S rRNA基因序列分析，主要分布在芽孢杆菌属、假单胞菌属和大肠埃希氏菌属，其中对地黄斑枯病和根腐病都具有拮抗作用的内生菌主要集中在芽孢杆菌属中。

关键词：怀地黄；内生细菌；抑菌活性；生物防治

中图分类号： S182文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0082-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-09-01

基金项目：国家自然科学基金（编号：21277041、21477035）；河南省高校科技创新团队支持计划（编号：13IRTSTHN009）。

作者简介：王瑞飞（1983—），男，河南汝州人，博士，讲师，主要从事农业资源与微生物学研究。E-mail：wswrf@163.com。

通信作者：杨清香，博士，教授，主要从事资源与环境微生物学研究。E-mail：yangqx66@163.com。[HJ]

[ZK）]

植物内生菌（endophyte）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物[1]。它们能够产生与宿主相同或相似的生理活性物质，有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制、抗氧化等生物学活性[2-5]。已有的报道显示，从内生菌中发现新活性化合物的比例为51%，超过土壤微生物的38%[6]，因此，利用植物内生菌筛选高效、新颖、低毒的抗菌活性物质潜力巨大。除了能够促进植物生长和赋予植物抗逆性[7-8]之外，植物内生菌还可以通过分泌抗生物质和诱导植物系统抗性[9]等不同机制，来减轻和防治植物病虫害。植物内生菌的以上特性使其成为医药工业、农用化学品工业研究的一个新起点[10]。

怀地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）多年生草本植物，主产于河南、辽宁、河北、山东、浙江等地。它以根入药，具有多种药效，常用于治病养生、滋补保健、清热凉血、养阴生津[11]，具有广泛的临床应用价值和重要的经济价值。但是，对于怀地黄内生菌的研究并不深入。本研究对采自河南省焦作市武陟地区的怀地黄进行内生菌的分离筛选，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、地黄斑枯病菌和地黄根腐病菌为供试菌株，对所得菌株进行抗菌活性的初步研究，探讨怀地黄内生菌对不同病原菌的拮抗作用，为开发利用地黄植物内生菌资源提供了初步的试验依据。

1材料与方法

[HTK]1.1材料[HT]

1.1.1植物材料怀地黄于2012年11月采自河南省焦作市武陟地区。

1.1.2供试菌种大肠杆菌（Escherichia coli，革兰氏阴性）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革兰氏阳性）和黑曲霉（Aspergillus niger，霉菌）均由河南师范大学环境微生物实验室保存，地黄斑枯病病菌（Septoris digitalis）和地黄根腐病病菌（Fusarium silani）2种病原真菌购自河南科技学院。

1.1.3培养基细菌培养采用LB培养基，真菌培养采用PDA培养基[12]。

1.2方法

1.2.1内生菌的分离纯化与保存[11]

取新鲜的怀地黄块根，用清水洗去表面泥土，在无菌条件下去除表皮，依次用70%乙醇浸泡3 min、0.1%HgCl2溶液浸泡3 min、70%乙醇分别浸泡1 min，然后用无菌水清洗5～7次，放置在无菌吸水纸上晾干；取最后1次清洗水涂布于LB培养基上，37 ℃培養 2 d，检测表面消毒是否彻底。用无菌刀片将消毒后的怀地黄块根切成1 cm见方的小块，接种于LB培养基上，于37 ℃培养 2 d。待平板上怀地黄块周围长出菌后，转移到新鲜培养基上进行划线分纯。再等培养基上有菌长出后，立即挑选新的菌落进行纯化，直到平板上菌落外观形态一致为止，将纯化后的单一菌株在试管斜面中划线，并于4 ℃条件下保藏。

1.2.2内生菌抗菌活性测定

本试验采用平板点接法、平板对峙法[11]和菌饼法[13]来测定内生菌的抗菌活性。

平板点接法应用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，将经平板活化后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌配置成一定浓度的菌悬液，细胞浓度一般为105～106 CFU/mL之间。将悬液均匀涂布于LB培养基上，将分离出的内生菌点接于平板上，37 ℃培养24～48 h，看是否有抑菌圈的出现，统计抑菌强度大小。

平板对峙法用于黑曲霉，将分离出的内生菌和黑曲霉分别接种于PDA平板上，两者相间隔2 cm，于28 ℃培养5～7 d，看分离出的内生菌是否对黑曲霉有抑制效果。处理组菌丝生长速度慢于对照组则表明此内生菌对黑曲霉有抑制效果。

菌饼法应用于地黄根腐病菌（Fusarium silani）和地黄斑枯病菌（Fusarium wilt）拮抗内生菌的筛选。将分离出的内生菌配置成一定浓度的菌悬液，细胞浓度一般为105～106 CFU/mL 之间。将悬液均匀涂布于LB培养基上，地黄病原菌分别接种于PDA平板上，在接菌的PDA平板上打孔挑取直径为5 mm地黄枯萎病菌和地黄根腐病菌菌饼接种于LB平板中，挑取菌饼于空白LB平板作对照。28 ℃培养5～7 d，观察菌落生长情况及抑制效果。按下列公式计算抑制率：菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。endprint

1.2.3内生细菌鉴定将纯化后的菌株进行DNA提取[14]、16S rRNA的扩增和测序。采用16S rRNA通用引物27f （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增[15]。将提取的DNA送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列检测，利用BLAST与GenBank数据库中16S rRNA基因序列进行比对分析，通过MEGA 4.1软件对同源序列以及相关标准菌株的序列进行多重序列比对，运用NJ（Neighbor-Joining）法构建系统发育进化树，初步确定菌株的分类地位。

2结果与分析

2.1活性内生细菌分离和抑菌活性测定

采用严格的组织表面消毒法，对地黄块根进行了内生细菌的分离，共获得32株内生细菌。利用大肠杆菌、金黄色球菌、黑曲霉、地黄斑枯病病菌和地黄根腐病病菌作为供试菌种对所分离的内生菌的抑菌效果进行研究。结果表明，32株地黄内生细菌对5种供试菌有不同程度的抑制效果。抑制大肠杆菌的活性菌占分离总菌数的56.3%，抑制金黄色葡萄球菌的活性菌占分离总菌数的53.1%，抑制黑曲霉的活性菌株占分离总细菌数的比例高达75.0%，抑制地黄斑枯病病菌的活性菌株占分离总细菌数的18.8%，抑制地黄根腐病病菌的活性菌株占分离总细菌数的9.4%。在这些具有抗菌活性的菌株中，DH-10和DH-11这2株细菌对5种供试菌均能有效抑制（表1）；1株细菌DH-01对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和地黄斑枯病病菌均能有效抑制（表1）；1株细菌 DH-23 对金黄色葡萄球菌、黑曲霉、地黄斑枯病病菌和地黄根腐病病菌均能有效抑制（表1）；8株菌（DH-01、DH-10、DH-11、DH-17、DH-26、DH-27、DH-28和DH-29）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉均能有效抑制（表1）。活性内生菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑制效果举例见图1。这些结果表明，地黄内生菌中的部分菌株具有较为广谱的抗菌活性。

针对能够导致地黄斑枯病和根腐病的病原菌的进一步分析显示，32株地黄内生细菌中有6株内生细菌（DH-01、DH-06、DH-08、DH-10、DH-11和DH-23）对地黄斑枯病有抑制作用（图2），DH-8和DH-10抑制作用最强，抑制率达95%以上；有3株内生菌DH-10、DH-11和DH-23对地黄根腐病病菌表现出明显的抑制（图2），其抑菌率依次为94.2%、71.4%、85.7%。值得关注的是，具有抑制地黄根腐病病菌作用的3株内生菌同时也具备抑制地黄斑枯病的作用，尤其是DH-10对2种病原真菌的抑制率均达到了94%以上，有望被用作生物防治菌种进行开发利用。

2.2活性内生菌的鉴定

对所分离的32株内生菌分别进行16S rRNA基因序列分析和BLAST比对，构建系统发育树（图3）。结果显示，这32株内生菌主要分布在芽孢杆菌属、假单胞菌属和大肠埃希氏菌属。

在这些内生菌中，分布于芽孢杆菌属的25株占总分离菌株数的78.1%。其中，2株活性菌DH-10和DH-11分别与Bacillus tequilensis和Bacillus vallismortis有99%和84%的相似性，且对5种供试菌都有抑制作用。除了这2株菌外，还有2株菌对地黄根腐病病菌有抑制作用。分布于假单胞菌属的4株菌占总分离菌株的12.5%，主要集中在Pseudomonas brassicacearum和Pseudomonas fluorescens。其中有3株菌不同程度的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉，有1株菌DH-23对地黄斑枯病病菌和根腐病病菌有抑制作用。分布于大肠埃希菌属的3株菌占总分离菌株的9.4%，其中DH-08对地黄斑枯病病菌有一定的抑制作用，DH-17对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉都有抑制作用，对于该属菌的生

[FK（W21][TPWRF1.tif][FK）]

防抗菌作用还未曾见报道。

3结论与讨论

从怀地黄根中分离得到32株内生细菌，这些内生菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉都有不同程度的抑制作用，其中8株内生菌对革兰氏阴性和阳性细菌以及霉菌都有抗性，显示抗菌谱广、抗菌活性强的特性；其中有2株細菌DH-10和DH-11对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、地黄枯萎病病菌和地黄根腐病病菌5种供试菌株都有拮抗作用，且抗菌活性较强。

采用细菌16S rRNA基因序列对分离出的32株细菌进行分子生物学鉴定和遗传进化分析发现，这些内生菌主要分布在芽孢杆菌属、假单胞菌属和大肠埃希菌属中。其中对怀地黄枯萎病和根腐病病菌都有抑制作用的菌株主要分布在芽孢杆菌属中。本研究发现具有最广谱抗菌活性的DH-10和DH-11分别与芽孢杆菌属中的Bacillus vallismortis 和Bacillus tequilensis具有密切的亲缘关系。Michael等于1996年首次从土壤中分离得到Bacillus vallismortis，证明这株菌与枯草芽孢杆菌密切相关[16]。Gatson等于2006年首次发现Bacillus tequilensis 16S rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌表现出

[FL）]

[FK（W11][TPWRF2.tif][FK）]

[FL（2K2]99%的相似性[17]。已有的报道显示，枯草芽孢杆菌广泛应用于植物根部、枝干、叶、花部以及果蔬采后病害防治方面[18]，甚至用于人和动物疾病的治疗和预防。因此，本研究首次从地黄内生菌中分离到的这2种芽孢杆菌可能与枯草芽孢杆菌在一些生理活性上具有密切关联性，比如它们的抑菌活性。除此之外，本研究中分离得到的芽孢杆菌属内生菌中存在大量抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉的活性菌。目前，普遍的观点认为芽孢杆菌主要通过营养和空间位点竞争、抗菌物质产生、溶菌作用、诱导植物抗病性等方面来发挥其防病促生作用[19-20]。正是通过这些相关机制，芽孢杆菌杀菌剂对多种植物病原菌产生较强的拮抗作用，并同时具备环境兼容性好、抗逆性强、对人畜安全、不易产生抗药性等优点[21]。endprint

因此，利用所获得的具有抗菌活性的芽孢杆菌进一步深入进行研究，开发相关微生物菌剂是笔者后续要进行的重要工作之一。

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