大粒型水稻材料千粒质量的QTL检测

汪欲鹏+武志峰+欧阳鸿飞+王智权+谭雪明+石庆华+潘晓华 吴自明

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.012[HT9.]

摘要：为挖掘控制水稻千粒质量的数量性状位点（QTL），同时为水稻超高产育种提供重要的育种材料，利用大粒型水稻材料lg1与常规籼稻品种9311构建的F2代遗传分离群体，采用完备区间作图法（ICIM），以LOD值2.5为阀值，对水稻千粒质量QTLs进行检测、分析。结果表明，F2代群体中千粒质量性状呈连续变异的单峰分布，为多基因控制的数量性状；共检测到千粒质量QTLs 5个，分布于第2、5、9号染色体上，LOD值介于2.65～11.77之间，表型贡献率变异范围为4.62%～52.78%，其中表型贡献率大于10%的主效QTLs共有3个；除[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]等位基因来源于9311外，其余4个QTLs增效等位基因均来自大粒材料lg1。定位的QTLs所在区间均有相关QTLs或基因被报道，是否为等位基因则需进一步试验验证。研究结果为大粒材料lg1千粒质量QTLs的精细定位及其在水稻超高产育种中的应用奠定了基础。

关键词：水稻；大粒型；千粒质量；数量性状位点（QTL）

中图分类号： S511.03文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0046-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-05-20

基金项目：江西省科技支撑计划（编号：20121BBF60009、20132BBF60004）；国家自然科学基金（编号：31560350）。

作者简介：汪欲鹏（1990—），男，江西赣州人，博士研究生，主要从事作物生理与遗传育种研究。E-mail：wypkj23@163.com。

通信作者：吴自明，博士，教授，主要从事作物生理与遗传育种研究。E-mail：wuzmjxau@163.com。

[ZK）]

水稻是世界上重要的粮食作物，其产量的提高对解决粮食安全问题具有重要的推动作用。千粒质量性状与水稻产量息息相关，同时也是重要的品质性状，它主要通过控制谷粒的大小及灌浆程度，最终影响水稻的产量[1-3]。随着耕作方式和水肥管理措施的日益改进，通过增加单位面积有效穗数的方法已很难实现水稻产量的大幅度提高，而增加穗质量有利于水稻进一步增产[4]。改善水稻千粒质量是增加穗质量的主要途径之一，有研究表明，千粒质量每提高1 g，产量可增加400 kg/hm2[5]。另外，通过分子标记辅助选择技术，将控制水稻千粒质量数量性状位点（QTL）或基因导入水稻品种，进而改善水稻千粒质量，是提高水稻千粒质量的重要方法[6-7]。因此，挖掘控制水稻千粒质量的QTLs或基因对水稻产量的增加具有重要意义。

水稻千粒质量主要受谷粒大小、灌浆程度的影响，在遗传上一般表现为多基因控制的数量性状，而构建定位群体的双亲之间千粒质量存在极显著差异是进行千粒质量相关QTL定位的重要前提。张亚东等利用特大粒粳稻材料TD70（千粒质量达80 g）和常规籼稻品种Kasalath杂交、多代自交构建的重组自交系群体，定位得到一系列与谷粒大小相关的QTLs，同时也发现了[WTBX][STBX]qGT2.2、qGW9、qGT9[WTBZ][STBZ]可能的新QTLs[8]。张强等利用极端大粒材料SGL156（千粒质量71.90 g）和特小粒材料川7杂交、回交获得的BC2F2群体，检测到28个与谷粒大小相关的QTLs，并发现了一系列可能的新QTLs[9]。孙滨等利用籼稻品种BG1（千粒质量达57.65 g）和粳稻小粒品种XLJ杂交建立的重组自交系群体，共检测到34个粒型、粒质量相关的QTLs，同时也定位到了一些可能的新的QTLs[10]。此外，已经克隆或精细定位的与千粒质量相关的基因[WTBX][STBX]GS3[WTBZ][STBZ][11]、[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ][12]、[WTBX][STBX]qGL3.1[WTBZ][STBZ][13]、[WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ][14]和[WTBX][STBX]GL2[WTBZ][STBZ][15]等均发现于大粒型水稻材料。因此，大粒型水稻材料是挖掘新的粒型、粒质量QTLs或基因的理想材料。

本研究利用发现于常规籼稻品种96-6种植田间的特大粒材料lg1（千粒质量47.58 g）与常规籼稻品种9311杂交、自交构建的F2代遗传分离群体，采用完备区间作图法，对其控制千粒质量的QTLs进行检测和分析，以期为新的千粒质量QTL位点的精细定位和克隆奠定基础，同时也为大粒材料lg1在超高产育种中的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

大粒型材料lg1是来源于常规籼稻品种96-6种植田间发现的特大粒材料，经多年种植确认其大粒性状可以稳定遗传。利用籼稻品种9311与大粒材料lg1配制F2代分离遗传群体，用于千粒质量性状的QTL检测。大粒材料lg1、9311及F2代群体均种植于江西农业大学科技园，所有材料采用小区种植，60株/小区，株行距约20 cm×20 cm，正常水肥管理。

1.2千粒质量性状的测定

在成熟期，除去边株，分别随机收取lg1、9311各10株，F2代群体213株单株用于千粒质量性状分析。千粒质量利用万深SC-G自动考种仪进行测定，具体为每个单株取300粒左右饱满种子称质量，换算为千粒质量，即为该单株的千粒质量，其中lg1、9311测定10个单株，取平均值，作为该材料的千粒質量。

1.3PCR扩增及电泳分析

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[16]（略有改进）提取水稻分蘖期叶片DNA，-20 ℃保存。PCR扩增采用 10 μL 体系：1 μL 10×buffer，0.2 μL dNTP Mix（各 2 mmol/L），2 μL引物（F、R各 2 μmol/L），0.1 μL rTaq酶，1 μL DNA模板，ddH2O补足至 10 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30个循环；72 ℃ 2 min。PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，电泳结果经0.1%硝酸银染色，蒸馏水洗涤，1.5% NaOH溶液显色后，观察带形。endprint

1.4连锁图谱的构建及千粒质量的QTL检测

利用大粒材料lg1、9311对笔者所在实验室保存的512对SSR标记、Indel标记进行多态性筛选，将获得的多态性标记对F2代群体中213个单株进行基因型分析，其中带形与lg1相同的记为2，与9311相同的记为0，杂合型记为1。利用QTL IciMapping 4.0软件中MAP功能进行遗传连锁图谱构建，采用软件bip功能中的完备区间加显性模型（ICIM-ADD），以LOD值2.5为阀值，扫描步长1.0 cM，在全基因组范围进行千粒质量性状QTL检测，QTL的命名遵循McCouch的原则[17]。

[BT1+*8]2结果与分析

[HTK]2.1大粒型材料lg1与9311千粒质量性状分析[HT]

由图1、表1可知，大粒型lg1的穗型、粒型均要显著大于9311，是优质的大粒型水稻材料。此外，通过测定可知，lg1千粒质量约为47.58 g，比9311大60.26%，两者之间存在极显著差异，适合构建群体，进行千粒质量性状QTL的定位。

2.2F2代群体千粒质量性状分析

由图2可知，F2代群体中，千粒质量性状呈连续变异的单峰分布，这表明F2代群体中千粒质量性状是由多主效基因控制的数量性状；各单株千粒质量变化范围为29.49～46.74 g，平均值约为37.18 g，偏度、峰度均在-1.51～0.27之间，接近正态分布，说明获得的表型数据适合用于进一步的QTL检测分析。

[FK（W10][TPWYP2.tif][FK）]

2.3F2代群体单株基因型鉴定及遗传连锁图谱的构建

利用大粒lg1、9311对512对SSR、Indel标记进行筛选，共获得95对差异明显的多态性标記，多态率为18.55%。利用获得的95对多态性标记对F2代遗传分离群体中213个分离单株进行基因型鉴定，与lg1带形相同的单株基因型记为2，与9311带形相同的单株基因型记为0，杂合型单株记为1。将各单株的基因型值输入Map文件中，采用QTL IciMapping 4.0软件中的MAP功能进行连锁图谱的构建。结果表明，构建的图谱覆盖水稻基因组约2 196.67 cM，标记间平均距离为23.12 cM，每条染色体上的标记数为7.92个。

2.4千粒质量性状QTL检测结果分析

由表2、图3可知，本研究共检测到千粒质量QTLs 5个，分布于第2、5、9号染色体上，LOD值介于2.65～11.77之间，表型贡献率变异范围为4.62%～52.78%，其中[WTBX][STBX]qTGW-2-1、qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]贡献率分布分别达到了 52.78%、21.78%、17.73%，是3个控制千粒质量性状的主效QTLs。其中[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]加性效应为负值，增效等位基因来源于9311，检测到的其他4个QTLs加性效应均为正值，增效等位基因均来源于大粒材料lg1。

3结论与讨论

千粒质量是水稻产量性状的重要组成部分，定位和克隆与千粒质量相关的基因一直是水稻研究的热点领域。截至目前，已有[WTBX][STBX]GS3[WTBZ][STBZ][9]、[WTBX][STBX]TGW6[WTBZ][STBZ][18]、[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ][10]、[WTBX][STBX]GW5[WTBZ][STBZ][19]、[WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ][12]、[WTBX][STBX]GS5[WTBZ][STBZ][20]、[WTBX][STBX]GW8[WTBZ][STBZ][21]、[WTBX][STBX]GW6A[WTBZ][STBZ][22]等与千粒质量相关的基因被克隆，利用千粒质量相关的基因或QTLs开发分子标记，应用于品种改良中对水稻增产具有重要的现实意义。本研究利用大粒型水稻材

[FL）][FK（W18][TPWYP3.tif][FK）]

[FL（2K2]料lg1与9311构建F2代遗传分离群体，群体中千粒质量性状呈连续变异的单峰分布，同时，定位到5个与千粒质量相关的QTLs，表型贡献率介于4.62%～52.78%之间，说明千粒质量性状是由多个微效基因、主效基因控制的数量性状。定位到[WTBX][STBX]qTGW-2-1、qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]表型贡献率均大于17.73%，是3个主效的千粒质量QTLs。对这些QTLs进一步进行验证，表现稳定的QTLs可用于开发分子标记，应用于育种研究中。此外，[WTBX][STBX]qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]加性效应为正值，增效等位基因来源于大粒材料lg1，是控制其千粒质量的主效QTLs。

与前人的研究对比发现，本研究定位到的[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]所在区间RM7451～RM71已有千粒质量相关基因[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ]被克隆，该基因编码1个环形E3泛素连接酶，将底物锚定至蛋白酶体上进行降解，进而负调控谷粒细胞分裂[10]。另外，张亚东等也在此区间内定位到了[WTBX][STBX]qGW2-1、qGW2-2、qGT2-1、qGL2-1和qGT2-3[WTBZ][STBZ]等与粒型相关的QTLs[8]。定位到的[WTBX][STBX]qTGW-2-2[WTBZ][STBZ]所在标记区间RM71～RM13069也是千粒质量QTL定位的热点区域，张强等在此区间内定位到[WTBX][STBX]qTGW2-1、qRLW2-1和qGT2-1[WTBZ][STBZ]等与千粒质量相关的QTLs[9]；孙滨等也定位到千粒质量QTL [WTBX][STBX]qTGW2[WTBZ][STBZ]、粒宽QTL [WTBX][STBX]qGW2-1[WTBZ][STBZ]和粒厚QTL [WTBX][STBX]qGT2-2[WTBZ][STBZ][10]。[WTBX][STBX]qTGW-2-3[WTBZ][STBZ]定位区间RM13174～RM3763大小为79.86 cM，此区间内有大量与千粒质量相关的QTLs被报道[6，8，23-24]，同时已经克隆的[WTBX][STBX]GS2也在此区间内，GS2[WTBZ][STBZ]等位基因在miR396靶点发生1个稀有的显性突变，造成该基因表达显著上升，促进了细胞的分裂和生长，最终特异地增加了穗长、籽粒大小[12]。而关于[WTBX][STBX]qTGW-2-3是否与GS2等位，有待于进一步试验验证。qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]在RM17962～RM169标记区间内，已经克隆的千粒质量相关基因[WTBX][STBX]GW5在此区间内，GW5[WTBZ][STBZ]编码1个核定位蛋白，该基因的功能缺失后泛素不能转移到靶蛋白上，使得底物不能被特异识别和降解，从而激活了颖花外壳细胞的分裂，进而颖花外壳的宽度增加，最终谷壳的宽度、粒质量及产量都得到了提高[17]，[WTBX][STBX]qTGW-5-1定位的区间较小，推测GW5[WTBZ][STBZ]很可能是等位基因。检测到[WTBX][STBX]qTGW-9-1[WTBZ][STBZ]所在标记区间为RM3808～RM3249，Xie等在此区间内已经精细定位了粒宽基因[WTBX][STBX]GW9.1[WTBZ][STBZ][25]，孙滨等在该区间内定位到了[WTBX][STBX]qTGW9、qGT9、qGW9[WTBZ][STBZ][10]，[WTBX][STBX]qTGW-9-1所在区间较小，该位点很可能与GW9.1[WTBZ][STBZ]等位。endprint

[HS2]参考文献：

[1][ZK（#]高继平，祁澎，林鸿宣. 水稻产量数量性状的遗传调控机制研究进展[J]. 中国科学（生命科学），2013，43（12）：1007-1015.

[2]刘建丰，袁隆平. 超高产杂交稻产量性状研究[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2002，28（6）：453-456.

[3]Wang E C，Wang J J，Zhu X D，et al. Control of rice grain-filling and yield by a gene with a potential signature of domestication[J]. Nature Genetics，2008，40（11）：1370-1374.

[4]Wang Y X，Xiong G S，Hu J，et al. Copy number variation at the GL7 locus contributes to grain size diversity in rice[J]. Nature Genetics，2015，47（8）：944-948.

[5]黄庭旭，谢从寿. 水稻超高产育种问题初探[J]. 福建稻麦科技，1998，16（2）：5-7.

[6]朱玉君，樊叶杨，黄得润，等. 分子标记辅助选择在水稻育種中的应用[J]. 核农学报，2012，26（5）：756-761.

[7]谢建平. 水稻分子标记辅助育种研究进展[J]. 种子，2006，25（11）：43-45.

[8]张亚东，张颖慧，董少玲，等. 特大粒水稻材料粒型性状的QTL检测[J]. 中国水稻科学，2013，27（2）：122-128.

[9]张强，姚国新，胡广隆，等. 利用极端材料定位水稻粒形性状数量基因位点[J]. 作物学报，2011，37（5）：784-792.[ZK）]

[10][ZK（#]孙滨，占小登，林泽川，等. 水稻粒形和粒重性状的相关性分析及QTL定位[J]. 分子植物育种，2015，13（12）：2663-2672.

[11]Fan C，Xing Y，Mao H，et al. GS3，a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice，encodes a putative transmembrane protein[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，112（6）：1164-1171.

[12]Song X J，Huang W，Shi M，et al. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J]. Nature Genetics，2007，39（5）：623-630.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）][LM]

[KH*4D]

[HT8.]

[13][ZK（#]Qi P，Lin Y S，Song X J，et al. The novel quantitative trait locus [WTBX][STBX]GL3.1[WTBZ][STBZ] controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1；3[J]. Cell Research，2012，22（12）：1666-1680.

[14]Hu J，Wang Y，Fang Y，et al. A rare allele of [WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ] enhances grain size and grain yield in rice[J]. Molecular Plant，2015，8（10）：1455-1465.

[15]Che R，Tong H，Shi B，et al. Erratum：control of grain size and rice yield by GL2-mediated brassinosteroid responses[J]. Nature Plants，2015，2（1）：15195.

[16]Murray M G，Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4325.

[17]McCouch S R. Gene nomenclature system for rice[J]. Rice，2008，1（1）：72-84.

[18][JP3]Ishimaru K，Hirotsu N，Madoka Y，et al. Loss of function of the IAA-[JP]glucose hydrolase gene [WTBX][STBX]TGW6[WTBZ][STBZ] enhances rice grain weight and increases yield[J]. Nature Genetics，2013，45（6）：707-711.

[19]Weng J，Gu S，Wan X，et al. Isolation and initial characterization of [WTBX][STBX]GW5[WTBZ][STBZ]，a major QTL associated with rice grain width and weight[J]. Cell Research，2008，18（12）：1199-1209.endprint

[20]Li Y，Fan C，Xing Y，et al. Natural variation in GS5 plays an important role in regulating grain size and yield in rice[J]. Nature Genetics，2011，43（12）：1266-1269.

[21][JP3]Wang S，Wu K，Yuan Q，et al. Control of grain size，shape and quality [JP]by [WTBX][STBX]OsSPL16[WTBZ][STBZ] in rice[J]. Nature Genetics，2012，44（8）：950-954.[JP]

[22]Song X J，Kuroha T，Ayano M，et al. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight，yield，and plant biomass in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（1）：76-81.

[23]蔣钰东，罗俊涛，况浩池，等. 利用两个籼稻杂交F2定位水稻粒型、粒重QTL[J]. 分子植物育种，2015，13（8）：1689-1694.

[24]李孝琼，韦宇，高国庆，等. 水稻遗传图谱构建及粒形相关性状的QTL定位[J]. 南方农业学报，2014，45（7）：1154-1159.

[25]Xie X，Jin F，Song M H，et al. Fine mapping of a yield-enhancing QTL cluster associated with transgressive variation in an Oryza sativa×O. rufipogon cross[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，116（5）：613-622.endprint