凉粉草DNA条形码通用序列的筛选及其混伪品分子鉴定

魏星任+叶清莲+马新业+龙洁怡+张娇+严萍+詹若挺+陈蔚文

摘要：提取凉粉草基因组总DNA，使用通用引物扩增核基因ITS1、ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列并进行测序，使用CodonCode Aligner软件对完整序列进行拼接并对其进行比对，使用MEGA 7.0邻接法（neighbor-joining，NJ）法构建系统聚类树。结果表明，matK序列扩增成功率低；ITS1序列存在单一变异位点且测序成功率低；ITS2、rbcL和psbA-trnH等3个序列无变异位点，序列扩增成功率、测序成功率高，序列长度在233～671 bp，从系统聚类树上得出ITS2序列可以将凉粉草与其他3种混伪品区分开，而rbcL和psbA-trnH序列在区分时存在一定的混淆。ITS2序列可以考虑作为鉴别凉粉草的优选序列。

关键词：凉粉草；DNA条形码；分子鉴定；ITS2；混伪品

中图分类号： R282.710.3文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0032-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-25

基金项目：广东省高等院校学科与专业建设专项（编号：2013CXZDA011）；广东省普通高校创新团队项目（编号：2016KYTD02）；广东省大学生创新创业训练计划（编号：201610572099）。

作者简介：魏星任（1993—），女，广东揭阳人，硕士研究生，研究方向为中药质量标准。E-mail：524344346@qq.com。

通信作者：严萍，博士，副研究员，研究方向为中药质量标准。E-mail：yanping@gzucm.edu.cn。

[ZK）]

凉粉草（Mesona chinensis）为唇形科（Labiatae）凉粉草属（Mesona）植物，别称仙人草、仙草、仙人冻、薪草，是一类重要的经济和药用植物，全世界有8～10种，零星分布于印度东北部、东南亚及我国东南各省的广大地区[1]。在我国，主要分布于福建、台湾、浙江、广东、广西及云南等地。据《全国中草药汇编》记载，仙草性味涩、甘、寒，具清暑解渴、凉血解暑及利尿之功效[2]，主治中暑，小儿酢疱、丹毒入腹、消渴、感冒、高血压、黄疸、肾脏病、糖尿病和关节肌肉疼痛等。

长期以来，凉粉草以野生资源为主，不同地区的资源在长期进化过程中形成了在外部形态特征甚至内部的生理结构上的极大差异。随着用量的不断提升，凉粉草的种质资源问题得到了重视，分子标记是资源鉴定与评价有的效方法之一。关杰敏等得到了一种适合凉粉草基因组DNA的提取方法，能提供高质量的凉粉草总DNA[3]。李晓晖等表明，SCoT和ISSR等2种分子标记均适用于凉粉草种质资源的遗传多样性研究[4-5]。DNA条形码是一种特异性的分子鉴定技术，Chen等经过大样本量研究，证明DNA条形码应用于植物分子鉴定非常高的稳定性和准确度[6-12]，2015版《中国药典》第三部规定DNA条形码植物类药材鉴定以核糖体ITS2作为主体条形码，并以psbA-trnH为辅进行[13]。目前凉粉草的DNA条形码方面研究也只涉及单一序列ITS2，本研究选取了广东省、广西壮族自治区、福建省、台湾、江西省等地的凉粉草为样本，基本涵盖绝大部分凉粉草产地，并选用了核基因ITS1、ITS2序列和叶绿体基因rbcL、psbA-trnH和matK序列作为候选序列，旨在通过更多的凉粉草样本来优选出合适的候选片段作为DNA条形码鉴定该植物的序列。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验选取凉粉草26份，凉粉草样品试验号MB-01～MB-10采集自广州中医药大学2号山体（药王山），为各地移栽品种；MB-11～MB-26由广东南岭药业股份有限公司提供（详见表1）。试验标本经广州中医药大学中药鉴定教研室讲师林颖鉴定，凭证标本保存于广州中医药大学中药科学与工程研究中心。KM280868、FJ513094为Genbank上获得的凉粉草登录号。混伪品样本序列17份，均在Genbank上下载，其材料信息见表2。涉及凉粉草常见的混伪物种：线纹香茶菜（Isodon lophanthoides Buch. -Ham. ex D. Don H. Hara）、溪黄草（Isodon serra Maxim. Hara）和筋骨草（Ajuga ciliate Bunge）。

1.2仪器与试剂

所用仪器有BS224S型电子分析天平（德国赛多利斯公司），MJ-Mini型PCR儀（BioRad），DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像仪（法国VL），微量紫外分光光度计（北京天根有限公司），Milipore-Q型纯水仪（Millipore公司）。

试剂有DP321植物基因组DNA提取试剂盒、MD109 100 bp DNA ladder（北京天根有限公司）、DRR 100B Ex Taq（TaKaRa），ITS1、ITS2、rbcL、psbA-trnH引物（华大基因科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1DNA提取将采集到的新鲜样品用75%乙醇洗净表面，置于烘箱中40 ℃烘干，称取样品30 mg加入液氮中充分碾磨。按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作并用微量紫外分光光度计测定提取的DNA浓度及纯度。

1.3.2聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）扩增及测序本试验所用引物序列及PCR条件见表3。PCR体系包括1.0 μL上、下游引物，1.0 μL基因组DNA，12.5 μL Taq酶，用ddH2O补充到25 μL；PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳并送华大基因科技有限公司完成双向测序。

1.3.3序列分析使用CodonCode Aligner V6.0.2对测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区的序列，使用DNAMAN 8.0进行多序列比对；使用MEGA 7.0对试验样本所得基因序列构建系统进化树，评价不同候选序列ITS2、rbcL和psbA-trnH对凉粉草的鉴定能力。endprint

2结果与分析

[HTK]2.1序列长度、葡萄糖含量和变异分析[HT]

ITS1、ITS2、psbA-trnH、rbcL序列电泳图条带清晰，无杂带，扩增成功率为96%，matK反复试验均扩增成功率低（图1）。ITS2、psbA-trnH、rbcL的测序成功率为100%，ITS1测序成功率为68%，远低于前三者的成功率，且ITS1存在2个变异位点，所以在本研究中ITS1、matK不作为推荐的优选序列。

[FL（2K2]由表4可知，不同的3条候选序列在序列长度、GC含量方面有较明显的差异。序列长度由高到低依次为rbcL、psbA-trnH、ITS2，GC含量从高到低依次为ITS2、rbcL、psbA-trnH。3条候选序列均无变异位点。

2.2不同候选序列对凉粉草及其混伪品的鉴定能力

采用NJ法构建不同序列的系统聚类树，利用Bootstrap法1 000次重复检验各分支的支持率，NJ树构建结果见图2。结果表明，ITS2序列能将所有的样品聚为两大支，其中凉粉草单独成一支，具有明显的单系性，然后与筋骨草聚为一大支，同时线纹香茶菜及其变种与溪黄草组成另外一大支；rbcL序列将所有的样品聚成两大支，凉粉草与筋骨草成为一大支，然而不能与其他混伪品形成的另一大支区分开；psbA-trnH序列凉粉草单独成支，然而无法与线纹香茶菜及其变种区分开。所以只有ITS2序列能够将凉粉草与其混伪品线纹香茶菜、溪黄草和筋骨草区分开，其他2个序列则无法完全区分。

3小结

本试验采用5条通用的候选DNA条形码序列对26个不同产地凉粉草样品及其混伪品进行对比研究。matK序列是叶绿体DNA中进化的比较快的序列，但是在凉粉草中很难成功扩增；ITS1的测序效率较低只有68%且存在2个变异位点；psbA-trnH、RbcL序列不能完全把凉粉草与本研究所用到的混伪品区分开；只有ITS2序列有较高的扩增效率和测序效率且能准确鉴别凉粉草与其他3种混伪品。所以建议优先选择ITS2序列作为鉴别凉粉草的DNA条形码的基因序列。

[FK（W20][TPWXR2.tif][FK）]

DNA的ITS序列，结果显示ITS序列在ITS1区段的第355位和ITS2区段的第578位存在2个碱基的差异[14]，与本研究结果有所不同，可能是试验收集样本不相同导致的。同时与师玉华等的结黄玉吉等通过克隆测序法测定了凉粉草不同品系核糖体论即ITS2序列能够鉴别凉茶药材凉粉草溪黄草、[JP3]断血流和筋骨草[15]相符合，本研究相对于马定乾等的研究的先进之处在于对热门通用序列进行了筛选，[JP2]验证了候选序列对于凉粉草的适用性和鉴别能力，所以得出的结论更加客观、全面。[JP]

本研究所涉及的混伪品数据全部来源于GenBank，且网上凉粉草混伪品相关数据较少，所以今后的研究中考虑增加混伪品试验样本数量。本研究虽然具有一定的不足，但仍然对凉粉草的分子鉴定有参考意义。[HT][FL）]

[KH*4D]

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