广陈皮DNA提取优化及茶枝柑的ISSR分子鉴别

席秀利+黄海波+楼步青+詹若挺+王浩涵

摘要：为提取优化广陈皮基因组DNA，同时利用简单重复序列间扩增（ISSR）分子鉴定技术快速、准确地鉴别茶枝柑及其近缘种。对比4种提取方法后择优提取广陈皮DNA；采用正交优化茶枝柑ISSR-PCR反应体系，筛选100条ISSR通用引物及其退火温度，从而对茶枝柑及近缘种进行遗传多态性分析。结果发现，通过对比cCTAB法提取陈皮组基因DNA产率较试剂盒法提高了10倍，且电泳检测条带清晰明亮，可为后续分子研究提供基础；通过筛选100条ISSR通用引物，最终筛选出10条适合茶枝柑及近缘种的引物，对其进行多态性分析并获得13种植物聚类分析图。因此可知，cCTAB法适合陈皮基因组DNA的提取，并可为其他果皮类植物基因组DNA提取提供参考；ISSR适合茶枝柑及近缘种的遗传多态性分析，可作为其有效分子鉴别手段。

关键词：DNA提取；ISSR；茶枝柑；近缘种；遗传多态性

中图分类号： S666.101文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0027-05[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-03

基金项目：国家公益性行业科研专项（编号：201407002）；广东省教育厅高校重点实验室滚动支持项目（编号：2013CXZDA011）。

作者简介：席秀利（1991—），女，湖南衡阳人，硕士，主要从事分子生物学研究。E-mail：840564430@qq.com。

通信作者：黄海波，博士，副教授，主要从事中药品质鉴定与质量评价研究。E-mail：2865055919@qq.com。

[ZK）]

芸香科（Rutacae）柑橘属（Citrus）植物茶枝柑（Citrus reticulata cv. chachiensis）的成熟果皮可入药。茶枝柑的果皮制干即为中药陈皮，陈皮具有理气健脾、燥湿化痰之功效，用于胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等疾病[1]。商业上用于制作中成药、中药饮片、陈皮茶、饮料、添加剂和香料等，具有很高的食用兼药用价值[2]。因其需求量巨大，同时由于环境、地域的差异，陈皮药材来源混杂、混伪品较多，造成了药材质量不稳定，难以保证临床用药的安全和有效，因此建立科学的鉴定方法是保证陈皮质量亟需解决的问题。

1994年，加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等提出分子标记采用简单重复序列间扩增（inter simple sequence repeat，简称ISSR）[3]。ISSR技术简易、快捷，引物设计无须预知基因组序列，只要是目标区域的长度在可扩增范围内，就能扩增出微卫星重复序列间的DNA片段[4]。ISSR综合了其他分子标记高多态性、可重复性、低成本易操作以及无须知道基因组序列的优点，已被广泛应用于种质收集、品种鉴定、遗传多样性以及SSR引物开发等研究[5]。

本研究通过经典十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[6]、mCTAB法[7]以及2种植物基因组提取试剂盒法对广陈皮药材基因组DNA提取进行探究，优化适合广陈皮DNA的提取方法，以期为今后广陈皮的分子研究提供保障。同時，利用ISSR标记对茶枝柑及近缘种进行遗传多态性分析，得到相关物种的ISSR聚类分析图，从而为茶枝柑及其近缘种植物鉴别提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

试验材料的收集包括广陈皮（Citrus aurantium L.）以及茶枝柑同属近缘13种，其中茶枝柑、福橘（Citrus reticulata Blanco cv.Tangerina）采自广东省、福建省等地，由广州中医药大学黄海波副教授鉴定，凭证标本保存于广州中医药大学。采集植物新鲜幼嫩叶片，用75%乙醇水溶液清洁叶表面后迅速置于硅胶密封袋中，快速干燥后保存于-20 ℃冰箱备用，试验材料详细信息见表1。

1.2仪器和试剂

OSE-Y20电动研磨仪[天根生化科技（北京）有限公司]，Arktik PCR仪（Thermo），T960 PCR仪（杭州晶格科学仪[HJ1.55mm]器有限公司），Power Pac Basic电泳仪（Bio-Rad），离心机（Eppendorf），Nano Drop 2000超微量紫外分光光度计[JP4]（Thermo），Tanon-2500[JP3]凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。[JP]

dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、Mg2+、10×ExTaq Buffer、DL5000Maker、琼脂糖（TaKaRa）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、CTAB、 β-巯基乙醇（Sigma公司）； 植物基因组提取试剂盒、RNase、loading buffer[天根生化科技（北京）有限公司]；其余为国产分析纯试剂；参考哥伦比亚大学提供的100条ISSR引物序列，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1广陈皮DNA的提取

试验对比植物基因组提取试剂盒DP305、DP320，经典CTAB法以及改良CTAB法4种方法后，选择优化改良CTAB法（cCTAB）作为最终提取陈皮基因组DNA的提取方法。

1.3.1.1缓冲液配制

细胞核分离液含0.10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、0.25 mol/L NaCl（5.00 mol/L）、5 mmol/L EDTA（pH值8.0）、2% PVP，加水定容至100 mL；2% CTAB缓冲液配方含0.10 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）、1.40 mol/L NaCl、20.00 mol/L EDTA（pH值8.0）、2% CTAB、2% PVP、2% β-巯基乙醇，加水定容至100 mL。endprint

1.3.1.2提取方法

称取50 mg干果皮，加20 mg PVP和 10 mg 抗坏血酸以及适量液氮于研钵中迅速研磨成粉末，将粉末迅速转入2.0 mL离心管中；将粉末弹至试管侧壁，加入1.0 mL预冷的核分离液，振荡混匀，12 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤共3次；加入0.8 mL预热的2% CTAB缓冲液配方，混匀后65 ℃水浴60 min，其间每隔10 min摇动1次；取出离心管冷却到室温，加入等体积的苯酚 ∶[KG-*3]三氯甲烷 ∶[KG-*3]异戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）颠倒混匀5 min；12 000 r/min离心5 min，吸上清液并置于新的2.0 mL离心管中；加入等体积三氯甲烷 ∶[KG-*3]异戊醇溶液（24 ∶[KG-*3]1），颠倒混匀5 min；12 000 r/min离心5 min，吸上清液并置于新的1.5 mL离心管中；加入1/10体积的3 mol/L NaAc和等体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀至出现丝状沉淀为止；10 000 r/min离心2 min，弃上清；加入 0.8 mL 预冷70%乙醇，轻轻弹起沉淀，静置悬浮5 min，10 000 r/min 离心1 min，弃上清；重复上一步骤；超净台上风干乙醇；加入100 μL TE和6 μL 10 mol/L RNase，37 ℃水浴30 min；放置于4 ℃冰箱过夜溶解后于-20 ℃长期保存。

1.3.1.3DNA产率和质量检测（1）琼脂糖凝胶电泳检测。

用琼脂糖凝胶电泳检测4种提取方法提取的DNA片段大小、降解情况。取5 μL DNA原液，加1 μL loading buffer，混匀后点入0.8%琼脂糖凝胶，150 V电泳15 min，在紫外凝胶成像仪上观察并拍照。

（2）微量分光光度计检测。

取2 μL DNA原液，用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定DNA的浓度及吸光度。

（3）PCR检测。

将cCTAB提取的DNA原液稀释到 50 ng/μL，用植物DNA条形码候选片段进行PCR扩增。所用引物為trnH/psbA[8]，PCR扩增采用10 μL反应体系，其中包括1×PCR buffer（含MgCl2），0.2 mmol/L dNTPs，各 0.5 μmol/L 上下游引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，50 ng模板DNA。PCR扩增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像仪观察并拍照。

1.3.2ISSR分子标记[HT]

1.3.2.1正交优化PCR反应体系

选择UBC 809为引物，以植物基因组提取试剂盒DP305提取的茶枝柑叶片基因组DNA为模板，针对PCR反应的Mg2+、dNTPs、ExTaq聚合酶、Primer和DNA模板的浓度共5个因素在4个水平上进行正交设计（表2）。

正交试验共16组，重复3次，PCR反应体系为20 μL，扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，40个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为100 V、40 min，结果经凝胶成像系统拍照分析。

1.3.2.2单因素内优化

参照正交试验体系优化的结果，对DNA模板浓度、Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度和Taq DNA聚合酶浓度用ISSR 809号引物进行交叉试验。反应体系参数设置如下：Mg2+设置1.00、1.25、1.50、1.75、200 mol/L 5个浓度梯度；dNTPs设置0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L 5个浓度梯度；ExTaq酶设置0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 U 5个浓度梯度；引物设置0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 μmol/L 5个浓度梯度；模板DNA设置20、30、40、50、60 ng 5个浓度梯度；1×PCR buffer，补充ddH2O至20 μL。

1.3.2.3[JP2]引物筛选以及退火温度优化

采用优化后反应体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物在其高于Tm值 2 ℃ 进行筛选，选择条带数量多、[JP]间距合适、清晰的引物进行退火温度优化。[JP]使用T960 PCR仪，以具体引物理论Tm为中心温度，设定退火温度梯度范围（5 ℃），自动形成12个梯度温度（50.0、50.5、51.2、52.2、53.4、54.6、55.8、56.9、58.0、59.0、59.4、60.0 ℃）进行筛选，从而确定引物适宜的退火温度。[JP]

1.3.2.4多态性筛选

采用优化后的反应体系及退火温度对茶枝柑、福橘、蜜橘3个不同地域的样品进行多态性筛选，选择条带清晰、间距明显且多态性比例大的引物，最终确定适合茶枝柑及近缘种的多态性引物。

1.3.2.5数据分析

利用Tanon-2500凝胶成像GIS软件对电泳图谱同一位置ISSR条带的有无进行统计，清晰地出现条带记为“1”，无条带记为“0”，条带不清楚的不予统计，形成“0/1”矩阵。利用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传距离，用UPGMA法进行聚类分析，绘制ISSR树状图。

2结果与分析

2.1陈皮DNA提取结果

2.1.1陈皮基因组DNA经0.8%琼脂糖电泳检测结果如图1所示，各个泳道均出现1条清晰的DNA条带，无蛋白质和RNA污染，无拖尾现象。endprint

[FK（W8][TPXXL1.tif][FK）]

2.1.2超微量紫外分光光度法检测结果如表3所示，cCTAB法提取的DNA纯度较高，质量浓度较均匀，符合试验要求。

[FL（2K2]2.1.3PCR检测cCTAB法提取陈皮基因组DNA如图2所示，结果检测能扩增出均一明亮条带，说明该方法提取DNA能为后续分子试验提供良好基础。

[FK（W7][TPXXL2.tif][FK）]

[HTK]2.2ISSR-PCR结果[HT]

2.2.1PCR反应体系正交优化结果分析

使用引物809对反应体系优化的电泳结果如图3所示，参考何正文等的直观评价法[9]依次对16个试验组结果多态性进行评分：条带数量丰富、清晰的计16分；涂布或无条带的计1分。1～16组的平均整数计分依次为8、12、2、1、1、14、6、11、1、12、13、16、1、1、9、10分，依照计分原则，以第12组反应体系（1×PCR buffer，1.50 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，0.20 μmol/L引物，0.75 U Taq酶，40 ng模板DNA）为最佳，对正交优化后的体系[CM（25]进行单因素优化后，得到最终反应体系：1×PCR[KG*3]buffer，[CM）][FL）]

[FK（W10][TPXXL3.tif][FK）]

[FL（2K2]1.5 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.0 U Taq酶，40 ng模板DNA。

2.2.2引物筛选及退火温度优化

以最佳反应体系对100条ISSR通用引物进行筛选，重复3次初筛选30条引物，从中优选15条清晰且背景亮度合适的引物进行12个退火温度梯度筛选，电泳图经Tanon-2500凝胶成像系统分析，根据信号强度判断条带，最终获得在最适退火温度下扩增的13条引物，见图4。[FL）]

[FK（W11][TPXXL4.tif][FK）]

[FL（2K2]2.2.3ISSR-PCR扩增的多态性分析

以茶枝柑、福橘、蜜橘3个地域差异大的样品进行多态性筛选，最终获得10条扩增带形完整、清晰、多态性丰畗的引物（表5）。利用这10条引物对13份材料进行ISSR扩增，共获得总条带914条，其中多态性条带共823条，多态位点数共占90.04%，多态性比例较高，说明茶枝柑及近缘种遗传多态性丰富。用表5中的826号引物对13份材料的多态性电泳结果见图5。

2.2.4ISSR标记的遗传相似性及聚类分析

利用NTSYS软件构建全部材料基于ISSR数据的相似系数（表6）以及UPGMA树状图（图6）。13份材料两两之间的相似系数在 0.475 0～0.825 0，以相似系数0.57为阈值可将13份材料划分为2组，体现了品种差异，茶枝柑、福橘、蜜橘、红橘、沙糖橘、瓯柑为第1分支，其中茶枝柑与福橘相似性最高。而在相似系数0.72处，茶枝柑则与福橘、蜜橘、红橘聚为一类，说明四者相似度较高；第2组则以浙江省采样为主，包括山下红、本地早、由良、椪柑、宫川、红美人与橘构成第2分支，说明同一地域样品相似度高；筛选的10条引物能在分子水平对茶枝柑及同属13种近缘种进行初步区分。

3讨论

植物细胞内含有大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成黏稠的胶状物，难以溶解或产生褐变，严重影响DNA提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增试验。本试验在对比2种试剂盒法和2种CTAB法后，选择改良CTAB法进一步优化。PVP是酚和多糖的络合物，能有效去除多酚和多糖[10]，抗坏血酸是抗氧化剂，可避免褐化[11]。本试验对比了在研磨时选择加入PVP和抗坏血酸，结果发现PVP和抗坏血酸以2 ∶[KG-*3]1的比例能有效防止样品氧化和褐变；而加入CTAB free缓冲液（即“1.3.1.1”节的细胞核分离液）洗涤3次可有效去除大部分代谢产物且降低提取液黏稠度；无水乙醇析出DNA速度快且含量多、无需冷藏，大大地减少了试验时间；最后加入的RNase消化30 min能较快溶解DNA且有效提高了DNA纯度，cCTAB法最终获得的DNA浓度较试剂盒法提高了10倍多[CM（25]，经济可行。由于陈皮样品较易于市场获得，故本研究在陈皮的DNA提取方法上进行了优化，以期为今后市场流通的商品陈皮样品的DNA分子鉴别提供参考依据。

ISSR分子标记技术简易、快捷、高多态性、引物通用[12-13]，但对反应体系要求较高，体系内细小变动可能导致试验结果及重复性较差。故本研究采用了正交设计法优化了茶枝柑的 ISSR-PCR 反应体系，同时通过单因素内优化、12个退火温度梯度优化、多态性筛选，最终从100条ISSR通用引物里筛选出10条清晰、条带丰富的作为茶枝柑及近缘种ISSR分子标记的引物。引物扩增多态位点比例90.04%，在分子水平证实了茶枝柑及近缘种间具有丰富的种内遗传多样性。通过NTSYS软件进行相似系数和UPGMA聚类分析，在分子角度对茶枝柑及近缘种13种材料进行初步区分，其中陈皮传统入药柑橘品种茶枝柑与福橘遗传相似系数最高，表明中药陈皮主要入药柑橘品种间亲缘关系较近。而聚类分析结果能够直观、科学地将茶枝柑与近缘种进行划分，为茶枝柑与其近缘种的科学筛选提供了分子生物学依据。

[HS2]参考文献：

[1][ZK（#]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：176.

[2]单杨. 柑橘加工技术研究与产业化开发[J]. 中国食品学报，2006，6（1）：423-427.

[3]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[4]周延清. DNA分子標记技术在植物研究中的应用[M]. 北京：化学工业出版社，2005.

[5]冯亮亮，唐红，李毅，等. 甘肃红砂不同种群遗传多样性的ISSR分析[J]. 草业学报，2011，20（1）：125-130.

[6]王关林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 2版.北京：科学出版社，2002.

[7]李金璐，王硕，于婧，等. 一种改良的植物DNA提取方法[J]. 植物学报，2013，48（1）：72-78.

[8][JP2]陈士林，庞晓慧，姚辉，等. 中药DNA条形码鉴定体系及研究方向[J]. 世界科学技术——中医药现代化，2011，13（5）：747-754.[JP]

[9]何正文，刘运生，陈立华，等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报，1998，23（4）：76-77.[ZK）]

[10][ZK（#]陈士林，姚辉，韩建萍，等. 中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J]. 中国中药杂志，2013，38（2）：141-148.

[11]贾晓梅，周悦，崔彬彬，等. 北美海棠组织培养中褐变影响因子分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（12）：91-93.

[12]陈淑吟，陆勤勘，张美如，等. 紫菜丝状体种质特性的ISSR分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（7）：17-20.

[13]刘君，李东，曾林，等. 利用ISSR分子标记分析辣椒种质资源遗传多样性[J]. 江苏农业科学，2016，44（7）：80-83.endprint