高效液相色谱-DAD法检测饲料中苯基脲类农药残留

李亚丽， 高文惠*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄，050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄，050000）

检测分析

高效液相色谱-DAD法检测饲料中苯基脲类农药残留

李亚丽1，2， 高文惠1，2*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄，050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄，050000）

本文建立了用高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）测定饲料样品中苯基脲类农药残留分析方法。测定中使用C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈和水，采用溶剂梯度结合波长和流速梯度等洗脱技术。实验结果表明：6种农药在20 min内实现了基线分离，线性相关系数≥0.9990，检出限为0.2～1.0 mg/L，平均回收率为83.6%～93.9%，其相对标准偏差(RSD)为1.24%～4.64%，该方法操作简单，灵敏度高，结果准确可靠。

饲料；苯基脲类农药；残留；高效液相色谱法；二极管阵列检测器

苯基脲类除草剂(PUHs)广泛应用于不同农作物芽前和苗后的一年生杂草，包括防除葡萄、甘蔗、棉花和大田作物中的单子叶和双子叶杂草。苯脲类除草剂属水溶性化合物，其在使用过程中的残留很容易通过迁移进入地表水和地下水中，对水源造成污染（金晶等，2017）。并且这类化合物降解速度较慢，通常可存在半年左右。研究表明，这类除草剂对人类有不同程度的毒性，有的甚至有致癌作用（熊力等，2012），因此对苯脲类除草剂进行检测非常重要，尤其是饲料中的农药残留超标问题，不仅会严重影响国内农畜产品在国际市场中的竞争力，还会对人们的身体健康造成一定的危害，因此，饲料中农药残留问题应引起人们的足够重视（乌仁图雅等，2014；崔淑华等，2013）。

农药残留常用的检测方法有近红外光谱技术（孙露萍等，2013）、气相色谱法（张妮等，2014）、气相色谱-质谱法(代飞飞等，2014)、高效液相色谱法 （何丛薇等，2015）、高效液相色谱-质谱法等（Golge 等，2015；赵桦林等，2013）、超临界流体色谱法（陈静，2015）、毛细管电泳色谱法（刘兴中，2014）、凝胶渗透色谱法（李军明等，2010）等。

本实验采用高效液相色谱 (HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)法，利用DAD的可变波长功能，结合波长、流速和溶剂梯度对饲料中的多种农药残留进行灵敏、快速的分离与检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 LC-1260型高效液相色谱仪 （安捷伦科技有限公司）；SK5200LHC型超声波清洗器（上海科导超声器有限公司）；LD-52A低速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；PHS-3C型pH计 （上海精密仪器有限公司雷磁仪器厂）；Millipore Synergy-超纯水机（法国Millipore公司）。

1.1.2 材料 甲醇和乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）。

标准品：丁噻隆（纯度≥99%）、枯莠隆（纯度≥99%），美国Accustandard工业公司；绿麦隆（纯度≥99%）、非草隆（纯度≥99%）、甲氧隆（纯度≥99%）、灭草隆（纯度≥99%），美国阿拉丁工业公司。

标准储备液的配制：分别准确称取丁噻隆、绿麦隆、非草隆、甲氧隆、灭草隆、枯莠隆各150 mg，用乙腈溶解后分别定容于100 mL容量瓶中。

样品：猪饲料、牛饲料和鸡饲料（市售）。

1.2 样品处理 称取5.000 g样品，研磨后用30 mL甲醇提取（提取两次，每次15 mL），超声20 min，于4000 r/min离心5 min，合并2次上清液，定容至30 mL，混匀，取10 mL过0.45μm微孔滤膜，超声脱气后备用（高林等，2015）。

1.3 色谱条件 色谱柱：Accurasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相是乙腈-水的二元溶液。采用溶剂梯度、流速梯度和波长梯度相结合的方式，具体见表1和表2。柱温为25℃；进样量为20μL。

表1 溶剂梯度和流速梯度程序

表2 波长梯度参数

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择 HPLC-DAD法具有适用性广、分辨率高、灵敏度好等优势，已经被广泛用于样品中农药残留的检测。众所周知，最佳检测波长的确定是HPLC-DAD色谱条件选择中非常重要的一个环节，确定最佳检测波长方能确保在该波长下目标物有最大的吸收。研究表明，苯基脲类农药常用的检测波长为240 nm，但是所测6种成分的最大吸收波长是不相同的，为保证各成分在最大吸收波长处检测，提高灵敏度，减少干扰，本实验根据各种物质的出峰时间和最大吸收波长设置了波长梯度，见表2。

2.2 流动相及流速的选择 本实验研究了甲醇-水和乙腈-水这两种流动相对6种苯基脲类农药分离的影响，以甲醇-水为流动相时，目标物质峰形较差，且丁噻隆和甲氧隆会出现不同程度的重叠，无法实现良好分离。当使用乙腈-水作流动相时，目标物质峰形较好，但是当乙腈-水的比例是45∶55（体积比）恒溶剂洗脱时，虽然6种苯基脲类农药出峰较快，但丁噻隆和甲氧隆无法实现分离，见图1a；而当乙腈-水的比例是35∶65（体积比）恒溶剂洗脱时，6种苯基脲类农药虽能实现分离，但保留时间偏长，其分离结果如图1b所示。因此本实验采用溶剂梯度和流速梯度洗脱技术，可以将6种苯基脲混合标准样品有效分离，见图1c。

图1 流动相及流速的选择

2.3 线性关系和检出限 将6种苯基脲类农药分别配制成质量浓度为0.01～200 mg/L的一系列标准溶液，采用1.3中的条件对一系列不同浓度的标准溶液进行测定。以浓度x对所测物质的峰面积y作图，则得到线性方程以及线性相关系数，如表3所示。

检出限是指在规定的某种条件下，样品中的被测物能够被检出的最低含量，用于考察检测方法灵敏度的大小。检出限一般是信噪比大于等于3（S/N≥3）。各物质的检出限如表3所示。

表3 6种苯基脲线性关系及检出限

2.4 样品测定 饲料样品按照1.2中方法处理，在1.3色谱条件下进行测定，其色谱分离如图2所示，在鸡饲料、猪饲料和牛饲料中未检出此6种农药。

图2 饲料样液色分离谱图

2.5 回收率和精密度实验 对猪饲料、牛饲料和鸡饲料样品在低水平和高水平2个添加水平下，进行加标回收率实验，结果见表4。平均回收率为83.6% ～93.9%，其相对标准偏差（RSD）为1.24%～4.64%（n=5）。说明本方法对苯基脲类农药的回收率较高，精密度好。

表4 加标回收率和精密度(n=5)

3 结论

本实验建立了采用波长、溶剂和流速梯度相结合的技术同时分离检测6种农药残留的HPLC-DAD法。6种农药在20 min内实现了基线分离，其线性相关系数≥0.9990，检出限为0.2～1.0 mg/L，平均回收率为83.6%～93.9%，其相对标准偏差（RSD）为1.24% ～4.64%(n=5)。该方法灵敏、准确、简便、快速，可用于饲料及其他样品中多种农药的检测。

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A method for the determination of phenylurea pesticide residue in feeds was developed using high performance liquid chromatography-diode array detection（HPLC-DAD）.C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm） was used，mobile phase was acetonitrile and water，solvent gradient was combined with wavelength gradient velocity gradient.The results showed that the six kinds of pesticides were achieved complete separation within 20 min，the correlation coefficients were over 0.9990，the detection limits were 0.2～ 1.0 mg/L，the average recoveries of the spiked samples were 82.4% ～ 97.3%，the relative standard deviations （RSD） were 1.25% ～ 5.13%.The method was simple，sensitive，accurate and reliable.

feed；phenylurea pesticide；residue；high performance liquid chromatography；diode array detector

S816.17

A

1004-3314（2017）17-0024-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171706

河北省科技计划项目（16275503D）；河北省食品药品监督管理局食品药品安全科技计划项目（ZD2015015）*通讯作者