早期针刺对创伤性脑损伤大鼠血清GFAP和S-100B蛋白水平的影响*

杜若桑 苑鸿雯 郑淑美 王宝华 崔 海（首都医科大学，北京 100069）

·实验报告·

早期针刺对创伤性脑损伤大鼠血清GFAP和S-100B蛋白水平的影响*

杜若桑 苑鸿雯 郑淑美 王宝华 崔 海△（首都医科大学，北京 100069）

目的 观察针刺对创伤性脑损伤（TBI）大鼠血清胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100B蛋白水平的影响，评估针刺对创伤性脑损伤的疗效。方法 按随机数字表法随机将120只雄性SD大鼠随机分成3组，每组40只：假手术组、模型组、针刺组。假手术组只开骨窗，不进行模型制备；模型组和针刺组制备TBI模型；针刺组造模后即接受针刺治疗，每日1次。术后6 h、1 d、3 d、5 d 4个时间点每组均随机选出10只大鼠进行血清GFAP、S-100B蛋白水平和改良的神经功能缺损（mNSS）评分观察与检测。结果 相较假手术组，模型组6 h即检测到血清GFAP和S-100B蛋白水平升高（P＜0.01）。伤后6 h、1 d检测发现针刺组GFAP水平比同期模型组降低（P＜0.05），伤后6 h、1 d、3 d检测发现针刺组S-100B蛋白水平比同期模型组显著降低（P＜0.01）。4个检测时间点上，模型组大鼠mNSS评分均高于同期假手术组（P＜0.01），针刺组评分显著低于同期模型组（P＜0.05或P＜0.01）。结论 TBI早期采用针刺干预可明显减轻大鼠脑损伤的程度。

创伤性脑损伤 针刺 GFAP S-100B蛋白 mNSS评分

创伤性脑损伤（TBI）是指因外力导致的脑部损伤。据统计，TBI发生率居外伤首位，也是外伤患者残疾甚至死亡的主要原因之一［1］。全球范围内每年有1千万以上的人因为TBI入院治疗甚至死亡［2］。TBI还是40岁以下人群残疾的首要原因［3］。TBI会导致运动、感觉、认知、精神障碍等问题，其中很多损害是终身性的［4］。TBI还有可能引起种种退行性疾病，如慢性创伤性脑病、阿尔兹海默病、帕金森病［5］。Hyder等预测到2020年TBI将成为全球第3大疾病负担［6］。目前缺乏对TBI安全而有效的药物治疗［7］，寻求探索可治疗TBI的治疗措施具有重大意义。有相当数量的临床研究显示单独针灸治疗或配合其他疗法对于TBI急性期或恢复期意识、肢体运动、认知、精神等障碍有确切疗效［8］。血清胶质纤维酸性蛋白 （GFAP）和S-100B蛋白对TBI有高度敏感性和特异性，TBI发生后，血液中的GFAP和S-100B蛋白水平可反映脑组织的损伤程度。本课题组观察了针刺对TBI大鼠行为学和血清中 GFAP、S-100B蛋白水平的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠120只，体质量200～300 g，由首都医科大学实验动物中心提供、饲养，室温温度（23±2） ℃，12/12 h 光照周期模拟昼夜交替，标准饲料喂养，自由饮水，将大鼠适应性喂养7 d后再进行试验。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》中的规定。

1.2 试剂和仪器 脑立体定位仪（68025，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，Thermo，USA），电热恒温培养箱（DH4000A，天津泰斯特），MINI shaker （MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），Rat GFAP ELISA KIT（上海蓝基生物科技有限公司），Rat S100B ELISA KIT（上海蓝基生物科技有限公司），水合氯醛（F20080911，国药集团化学试剂有限公司批号），一次性无菌针灸针（直径0.30 mm，长 25 mm，华佗牌）。

1.3 分组与造模 按随机数字表法，将120只大鼠随机分成3组，每组40只：假手术组、模型组、针刺组，每组根据伤后不同时间点再随机平均分成4个亚组：6 h组、1 d组、3 d组和5 d组。以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g体质量）腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠以俯卧位固定于脑立体定位仪，头部备皮消毒后，在其眼睛后方沿头部正中线做长约1.5 cm的纵行切口，暴露前囟。并以大鼠左侧脑半球，前囟旁开2.5 mm，向后1.5 mm处为圆心，用牙科钻钻出直径4 mm的圆形骨窗，避免大鼠硬脑膜受损。参考Feeney法［9］自制自由落体打击器进行撞击造模：将40 g的砝码自40 cm高处自由落体撞击打击大鼠硬脑膜。打击后清理创口，并在切口内滴注4万U硫酸庆大霉素0.2 mL以抗感染，将骨瓣还纳于骨窗中，并用骨蜡封闭。缝合头皮后将大鼠单笼饲养。假手术组：假手术组只开骨窗，不进行TBI模型制备。抗感染骨瓣还纳封闭同针刺组。

1.4 干预方法 针刺组于TBI造模后即针刺大鼠双侧风池穴、水沟穴、双侧内关穴1次，直刺进针约2～3 mm，穴位依照《大鼠穴位图谱的研制》［10］进行定位。风池、内关连接电针仪，电针参数采用疏密波波形，频率为2～10 Hz，电流强度0.1～0.3 mA，治疗每日1次，每次15 min。针刺组4个亚组（术后6 h组、1 d组、3 d组、5 d 组）各接受针刺治疗 1、1、3、5 次。

1.5 标本采集与检测 术后6 h、1 d、3 d、5 d 3个时间点每组均随机选出10只大鼠进行下列指标的观察与检测。1）血清GFAP、S-100B蛋白水平。mNSS评分后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，每只大鼠均进行腹主动脉采血5 mL取血清，以ELISA法，按试剂盒说明检测大鼠血清中GFAP、S-100B蛋白水平。2）改良的神经功能缺损评分（mNSS）。mNSS评分包含运动、感觉（视觉、触觉、本体感觉）、反射和平衡测试［11］。 满分为18分，分数越高代表神经损伤功能越严重。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以±s）表示，同期组间数据采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血清GFAP水平比较 见表1。根据模型组数据，伤后6 h即发现血清GFAP水平升高，随后其水平下降，但伤后1 d仍显著高于同期假手术组。伤后6 h、1 d检测发现针刺组GFAP水平比同期模型组减低（P＜0.05），和假手术组无明显差异（P＞0.05）。伤后 3 d和5 d时，各组同期数据相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组GFAP、S-100B蛋白水平及mNSS评分比较（

表1 各组GFAP、S-100B蛋白水平及mNSS评分比较（

与假手术组同期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组同期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别 时 间 mNSS评分假手术组 6 h 1.30±0.95（n＝10） 1 d 1.10±0.57 3 d 0.30±0.68 GFAP（ng/mL）S-100B 蛋白 （ng/mL）0.89±0.12 0.73±0.30 0.83±0.18 0.73±0.30 0.80±0.19 0.71±0.24 0.79±0.25 0.55±0.14模型组 6 h 1.21±0.18** 1.21±0.14** 11.40±1.65**5 d 0.10±0.32（n＝40） 1 d 1.17±0.19** 1.37±0.19** 9.20±1.69**3 d 0.87±0.22 1.47±0.18** 7.20±1.99**5 d 0.85±0.25 1.02±0.30** 5.60±2.37**针刺组 6 h 0.96±0.18△ 0.91±0.26△△ 9.65±1.65**△△（n＝40） 1 d 0.85±0.23△ 0.78±0.36△△ 6.50±0.85**△△3 d 0.82±0.17 0.75±0.28△△ 3.10±1.20**△△5 d 0.83±0.19 0.71±0.27 3.30±1.16**△

2.2 各组S-100B蛋白水平比较 见表1。根据模型组数据，大鼠伤后6 h即检测到血清S-100B蛋白水平升高，数值最高峰出现在3 d，到5 d仍维持在较高水平。伤后6 h、1 d、3 d检测发现针刺组S-100B蛋白水平比同期模型组显著减低（P＜0.01），和假手术组无明显差异（P＞0.05）。伤后5 d时，针刺组和其余两组差异无统计学意义（P＞0.05），但数值明显低于模型组。2.3 各组mNSS评分比较 见表1。经统计分析后发现，伤后 6 h、1 d、3 d、5 d 模型组 mNSS 评分均显著高于假手术组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而针刺组mNSS评分虽然高于同期假手术组（P＜0.01），但显著低于同期模型组（P＜0.05或P＜0.01），从数值上看针刺组数值显著低于同期的模型组。

3 讨 论

TBI可对人体产生诸多损害，根据损伤发生的时间，TBI可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤。原发性脑损伤是指外力对神经、血管等组织造成的直接损伤，发生于损伤当时，立刻产生临床效应，往往是不可逆转的。继发性脑损伤是随后发生的，主要是指颅内血肿和脑水肿，兴奋性谷氨酸毒性、炎性反应、氧自由基、Ca2+超载、缺血再灌注等病理性损害会导致一系列继发性损伤。诸多动物、临床研究已证实针灸对本病的疗效。

血清中可作为TBI标志物的几种蛋白一直受到广泛的关注，它们可以早期、高效地判断评估TBI病情、治疗效果和预后，其中GFAP和S-100B蛋白就是研究热度高的两种蛋白［12］。 夏小辉等［12］研究发现 TBI患者血清中GFAP、S-100B蛋白水平均在第2天达峰值，第4～6天进入平台期，S-100B蛋白和GFAP水平均与其病情严重程度和Marshall CT分类呈正相关，与脑组织损伤的严重程度关系密切，联合动态监测这2个指标对TBI患者的诊断及病情评估具有重要的临床参考价值。

GFAP是单节显性的中间丝状蛋白，特定地表达在星形胶质细胞中，是细胞骨架的主要组成部分［13］。它和反应性星形细胞增生密切相关，反应型星型细胞增生的典型表现是星形胶质细胞增生或肥大，是许多中枢神经系统疾病的主要病理现象。众多研究显示受损组织局部GFAP免疫反应活性的增强是神经元损伤的灵敏指标，也是星形胶质细胞增生活跃的敏感指标之一。在创伤或疾病导致的脑组织或脊髓细胞受损情况下血清 GFAP水平出现上升［14］，GFAP是 TBI损伤早期的可靠诊断依据之一，也和TBI严重程度和死亡率的有密切关系。Missler等通过对重型脑外伤患者的血清GFAP研究后发现，伤后3 h内，其血清中的GFAP水平即明显升高，损伤发生6 h后GFAP水平显著下降［15］。Cikriklar等研究发现脑外伤大鼠造模后2 h血清GFAP的升高和创伤的严重程度成正比［16］。Huang等采集了TBI大鼠伤后3 h、6 h、24 h后的血清，发现在伤后第3小时和6 h两个时间点上，血清中的GFAP含量均显著上升，但伤后24 h时GFAP和正常时无差异［17］。方永军等发现TBI大鼠血清GFAP含量在术后均有升高，术后第1天开始明显升高，至第7天达峰值，后逐渐下降，至第14天仍明显高于假手术组［18］。黄培赞等检测了大鼠TBI造模后1 h、6 h、24 h时的血清GFAP的含量，发现随着时间推移，其表达越来越高［19］。

S-100B蛋白也是一种TBI的特定的生物学标记［20］，也是近年来TBI标志物研究的热点之一［21］。S-100B蛋白属于钙结合蛋白家族，主要分布于星形胶质细胞和施旺细胞［22］，它参与调节复杂的神经元-神经胶质反应［13］，在TBI后通过破坏的血脑屏障进入血液。郭新荣等研究发现大鼠脑损伤发生后血清S-100B含量显著上升，表现为伤后第1天、第2天、第3天其含量逐步上升［23］。还有研究发现TBI大鼠血清S-100B蛋白水平在伤后6 h开始升高，24 h达高峰，72 h基本回复正常水平［24］。大鼠血清S-100B蛋白浓度在脑外伤后立即升高，并在第24小时达到高峰，此后虽有缓慢下降但直至伤后第7天仍保持在较高水平［25］。

本研究发现，TBI伤后6 h即检测到血清GFAP和S-100B蛋白水平升高，GFAP峰值出现在伤后6 h，S-100B蛋白出现在第3天。第3天和第5天TBI大鼠GFAP和假手术组大鼠无异，但TBI大鼠S-100B蛋白水平直到第5天仍保持在较高水平。验证了相关研究所说的TBI早期可应用GFAP和S-100B蛋白评估TBI病情、治疗效果和预后。伤后6 h、1 d检测发现针刺组GFAP水平比同期模型组降低，伤后6 h、1 d、3 d检测发现针刺组S-100B蛋白水平比同期模型组显著减低，说明早期针刺可减轻TBI大鼠的脑损伤。再结合mNSS 评分， 伤后 6 h、1 d、3 d、5 d 模型组 mNSS 评分均显著高于假手术组，说明TBI造模后，大鼠有显著的神经功能受损。而针刺组mNSS评分虽然高于同期假手术组，但显著低于同期模型组，从数值上看针刺组数值显著低于同期的模型组，说明针刺能改善TBI后神经功能损伤。以上数据从mNSS评分、GFAP和S-100B蛋白水平血清角度证实TBI早期采用针刺干预可取得不错的疗效治疗，可明显减轻大鼠脑损伤的程度。本研究虽证实针刺对TBI早期起效，但最佳干预时机及其具体起效机制仍待进一步研究。

［1］Maas AI，Stocchetti N，Bullock R.Moderate and severe traumatic brain injury in adults［J］.Lancet Neurol，2008，7：728-741.

［2］Ruff RL，Riechers RG.Effective treatment of traumatic brain injury： learning from experience［J］.JAMA，2012，308（19）：2032-2033.

［3］Fleminger S，Ponsford J.Long term outcome after traumatic brain injury［J］.British Medical Journal，2005，331（7530）：1419-1420.

［4］Roozenbeek B，Maas Andrew IR，Menon David K.Changing patterns in the epidemiology of traumatic brain injury［J］.Nature Reviews Neurology，2013，9（4）：231-236.

［5］Smith DH，Johnson VE，Stewart W.Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI： substrates of ementia［J］.Nature Reviews Neurology，2013，9（4）：211-221.

［6］Hyder AA，Wunderlich CA，Puvanachandra P，et al.The im-pact of traumatic brain injuries： a global perspective ［J］.Neurorehabilitation，2007，22（5）：341-353.

［7］Gultekin R，Huang S，Clavisi O，et al.Pharmacological interventions in traumatic brain，injury：can we rely on systematic reviews for evidence［J］.Injury，2016，47（3）：516-524.

［8］于淼，王珂，费智敏.颅脑损伤及其后遗症中医针刺治疗［J］.系统医学，2016，1（5）：78-80.

［9］Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to cortical injury I.Methodology and local effects of contusions in the rat［J］.Brain Res，1981，211（1）：67-77.

［10］华兴邦，李辞蓉，周浩良，等.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991（1）：1-5.

［11］Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2001，32（4）：1005-1011.

［12］夏小辉，周昌龙，贺学农，等.血清中S-100B、GFAP的水平对创伤性脑外伤的诊断及病情评估价值［J］.第三军医大学学报，2014，36（3）：283-286.

［13］Herrmann M，Vos P，Wunderlich MT，et al.Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke a comparative analysis of serum concentrations of protein S-100B and glial fibrillary acidic protein［J］.Stroke，2000，31（11）：2670-2677.

［14］Sofroniew MV，Vinters HV.Astrocytes： Biology and pathology［J］.Acta Neuropathol，2010，119（1）：7-35.

［15］Missler U，Wiesmann M，Wittmann G，et al.Measurement of glial fibrillary acidic protein in human blood：Analytical method and preliminary clinical results［J］.Clin Chem，1999，45（1）：138-141.

［16］Cikriklar HI，Uysal O，Ekici MA，et al.Effectiveness of GFAP in determining neuronal damage in rats with induced head trauma［J］.Turkish Neurosurgery，2016，26（6）：878-889.

［17］Huang XJ，Glushakova O，Mondello S，et al.Acute temporal profiles of serum Levels of UCH-L1 and GFAP and relationships to neuronal and astroglial pathology following traumatic brain injury in rats［J］.Journal of Neurotrauma，2015，32（16）：1179-1189.

［18］方永军，周雄波，周锋，等.淫羊藿苷对颅脑损伤大鼠血清MBP、GFAP 表达的影响［J］.陕西中医，2016，37（7）：923-925.

［19］黄培赞，赵金兵，赵鹏来，等.急性乙醇中毒对大鼠创伤性脑损伤后GFAP、AQP4表达的影响［J］.临床神经外科杂志，2016，13（4）：276-280.

［20］Raabe A，Grolms C，Sorge O，et al.Serum S-100B protein in severe head injury［J］.Neurosurgery，1999，45（3）：477-483.

［21］Welch RD，Ayaz SI，Lewis LM，et al.Ability of serum glial fibrillary acidic protein，Ubiquitin C-Terminal Hydrolase-L1，and S100B to differentiate normal and abnormal head computed tomography findings in patients with suspected mild or moderate traumatic brain injury［J］.Journal of Neurotrauma，2016，33（2）：203-214.

［22］Scha¨fer BW，Heizmann CW.The S100 family of EF-hand calciumbinding proteins： function and pathology［J］.Trends Biochem Sci，1996（21）：134-140.

［23］郭新荣，王瑞辉，吴涛.使用eCCI仪制备大鼠TBI动物模型及血清S100B和NSE含量变化［J］.实验动物科学，2013，30（5）：23-27.

［24］廖创新，叶惠韶，郭泽龙.醒脑注射液对颅脑损伤后大鼠血清S100B、NSE的干预作用［J］.中国微侵袭神经外科杂志，2006，11（9）：416.

［25］袁雪松，卞晓星，戚传平.血必净对大鼠外伤性脑损伤后血清S100B和IL-6水平的影响［J］.江苏大学学报医学版，2006，11（9）：35-38.

Effects of Early Acupuncture on Serum GFAP and S-100B Protein in Rats with Traumatic Brain Injury

DU Ruosang，YUAN Hongwen，ZHENG Shumei，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

Objective： To observe the effect of acupuncture on serum glial fibrillary acidic protein （GFAP） and S-100B protein in rats with traumatic brain injury （TBI），and to evaluate the therapeutic effect of acupuncture on traumatic brain injury.Methods： 120 male SD rats were randomly divided into 4 groups，40 rats in each group：the sham operation group，the model group and the acupuncture group.In the sham operation group，only the bone window was opened and the model was not prepared；the TBI model was prepared in the model group and the acupuncture group；the acupuncture group

acupuncture treatment once a day after molding.6 h，1 d，3 d and 5 d after operation were taken as four time points.10 rats were randomly selected from each group at one time point.The contents of serum GFAP，S-100B protein and mNSS were observed and detected.Results： Compared with the sham operation group，the serum GFAP and S-100B protein levels increased in the model group only after 6 h（P<0.01）.At 6h and 1d after injury，it was showed that the GFAP level in the acupuncture group was lower than that in the model group（P<0.05）.Data of 6 h，1 d and 3 d showed that the level of S-100B protein in the acupuncture group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）.The mNSS scores of the model group were higher than those of the sham operation group （P<0.01） and the score of the acupuncture group was significantly lower than that of the model group （P<0.01 or P<0.05）.Conclusion： Early intervention with acupuncture can obviously relieve the brain damage in rats with TBI.

Traumatic brain injury；Acupuncture；GFAP；S-100B protein；mNSS score

R245.3

A

1004-745X（2017）09-1589-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.026

2017-05-26）

首都医科大学科研基金项目（自然科学类）（17ZR26）

△通信作者（电子邮箱：drcuihai@163.com）