发酵前后草莓果实与草莓果酒中三种有机酸的定量分析

张源，张新红，兰伟，郭斌，王明跃，刘文福

（1.阜阳职业技术学院生化工程系，安徽阜阳，236000；2.阜阳师范学院生物与食品工程学院，安徽阜阳，236037；3.阜阳市鸿福农业科技股份有限公司，安徽阜阳，236000）

发酵前后草莓果实与草莓果酒中三种有机酸的定量分析

张源1，张新红，兰伟2，郭斌1，王明跃1，刘文福3

（1.阜阳职业技术学院生化工程系，安徽阜阳，236000；2.阜阳师范学院生物与食品工程学院，安徽阜阳，236037；3.阜阳市鸿福农业科技股份有限公司，安徽阜阳，236000）

为分析草莓果酒发酵前后有机酸的代谢变化，及其与果酒品质之间的关系，利用高效液相色谱法对草莓果实及发酵后制得的草莓果酒中的三种有机酸含量进行了定量分析。主要结果如下：（1）色谱条件：采用C18柱（4.6×250 mm,5 μm）分离，以0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH=2.28，磷酸二氢钾：甲醇=98∶2）作为流动相等度洗脱，流速1 mL/min，210 nm紫外检测、外标法定量。该方法可有效分离草莓汁中的乳酸、乙酸和柠檬酸，分析速度快，重现性及灵敏度高。（2）液相色谱分析表明：柠檬酸是草莓果实中最主要的有机酸，使用安琪RW酵母菌发酵，发酵过程中基本不代谢柠檬酸，也基本不产生新的有机酸种类，使得柠檬酸在草莓酒中占绝对优势，果酒口感较为寡淡。（3）在草莓酒的后期陈酿过程中，可能存在乳酸菌对柠檬酸的代谢，使草莓酒中的乳酸含量增加，香气改善。（4）自然发酵的草莓酒，柠檬酸含量大幅降低，乳酸与乙酸含量大幅升高，果酒口感醇厚，香气浓郁，表明乳酸菌、醋酸菌在草莓酒的酿造中具有其特殊作用，但自然发酵时总酸含量过高的问题亟需解决。

草莓；草莓果酒；高效液相色谱；有机酸；乙酸；乳酸；柠檬酸；定量分析

阜阳市是安徽省主要的草莓产区之一，至2015年，全市草莓种植面积已突破2.3万亩（1 533.3 hm2），在安徽省范围内种植规模仅次于长丰县[1]，草莓种植已成为当地农民脱贫致富的重要途径之一。但随着草莓种植面积的不断扩大，阜阳市草莓产业的结构性矛盾也日益显现。由于草莓耐贮性差，常温下收获后的果实极易腐烂，加之生产季节性强，成熟收获期较为集中，长途储运困难，这些特点决定了草莓种植产业的发展必须有快捷的销售渠道与充足的市场空间或深加工产业作为支撑。如：合肥长丰草莓以合肥市为依托，北京昌平草莓以北京市为依托，在近距离就有很大的市场空间[1]。但阜阳市本身是一个农业大市，自身消费能力有限，在这样的现实条件下，发展本地的草莓深加工产业，通过延伸产业链消化产能势在必行。

草莓香气浓郁，果实多汁无核，是酿造果酒的理想原料。发展草莓果酒生产，可以就地消化草莓产能，是解决草莓主产区产能过剩的有效途径。目前，国内对草莓酿酒技术已进行了初步的研究，如：糖度、果胶酶添加量、pH值、SO2添加量、发酵温度等因素对草莓果酒酿造及品质的影响[2-12]。但上述研究大都直接借鉴葡萄酒的生产工艺，虽然基本解决了草莓果酒发酵中的基本共性问题，但对草莓作为酿酒原料的特殊性还缺乏研究，特别是对发酵前后草莓成分的物质转化及其与果酒品质之间的关系知之甚少。

初步的研究表明，草莓果实的有机酸成分与葡萄差异很大[6]，以柠檬酸为主，苹果酸与草酸含量很少，不含酒石酸[3]。而有机酸是果酒中的重要风味物质之一，是影响果酒感官质量的一个关键因素。有机酸的种类、含量与果酒的典型性、品质关系密切，调节着酸碱的平衡，影响其口感、色泽及生物稳定性[13]。

因此，有针对性的研究草莓发酵前后有机酸成分及含量变化，分析其与果酒品质之间关系，对进一步研究发酵过程中各种微生物的作用、改进发酵工艺、提高果酒品质、促进草莓果酒的商品化生产具有现实意义。

本研究利用高效液相色谱，对草莓果实及发酵后的草莓果酒中三种重要有机酸（柠檬酸、乳酸、乙酸）的含量及动态变化进行了定量研究，以期为草莓酒生产技术的后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 草莓果汁

新鲜草莓采自阜阳市闻集镇，品种为“甜查理”。经以下工艺流程制成草莓汁，冷冻保存待分析测定。

去果萼→破碎→加EX果胶酶40℃处理3 h→吸取澄清自流果汁→冷冻贮藏。

实验前，将预先处理好的草莓汁解冻，6 000转/分离心15分钟，吸取上清液，用0.45 μM滤膜过滤，稀释50倍备用。

1.1.2 草莓果酒

草莓果酒原料同1.1.1，为同批采摘，经发酵后制得：

酒样1的发酵工艺参考高兆建（2008），发酵罐容积10 L，20℃控温发酵。主要工艺流程：

去果萼→添加白砂糖至含糖量20%→添加SO2→接种酵母→20℃发酵→去皮渣→自然澄清。

酒样2的发酵工艺与条件同酒样1，但经6个月的室温陈酿。

酒样3为自然发酵，发酵罐容积10 L，无控温装置。主要工艺流程如下：

去果萼→添加白砂糖至含糖量20%→封罐→发酵→去皮渣→自然澄清→室温陈酿6个月。

1.1.3 三种草莓果酒的基本感官特性

三种草莓果酒的基本感官特性如表1所示。

表1 三种草莓果酒的基本感官特性

1.1.4 样品预处理

实验前，将三种酒样6 000转/分离心15分钟，吸取上清液，用0.45 μM滤膜过滤，稀释50倍备用。

1.2 仪器与试剂

日立L-2000Ⅱ型高效液相色谱仪，带紫外检测器。BL10-25A型超声波清洗器、HS-3E型pH计、无油真空泵、分析天平。乳酸（经测定含量86%）、乙酸、柠檬酸均为分析纯；甲醇为色谱纯；超纯水；EX果胶酶；安琪活性干酵母（RW），白砂糖（市售优级）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

采用C18柱（4.6×250 mm,5 μm）分离，以0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH=2.28，磷酸二氢钾：甲醇=98∶2）作为流动相等度洗脱，流速1 ml/ min，210 nm紫外检测、外标法定量。

1.3.2 流动相的配制

准确称取KH2PO41.36 g，超纯水溶解，定容至1 000 mL、用磷酸调pH为2.28。用无油真空泵（BF-S2000）经0.45 μm的一次性水系过滤膜过滤，过滤后用超级波清洗机除气泡备用。

1.3.3 标准曲线

分别准确称取柠檬酸、乙酸、乳酸（经测定含量85%）三种酸标准品，用超纯水将标准品溶解，定容成单标储备液。上述溶液梯度稀释成5组不同浓度的混标，经0.45 μm水相滤膜过滤后，在给定的色谱条件下，绘制出标准工作曲线。以有机酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立线性回归方程。

1.3.4 精密度和回收率试验

对同一浓度的有机酸标准品重复进样4次,测定各有机酸的峰面积和保留时间，计算RSD值。取同一样品三份，其中一份样品做本底，另两份各加入一定含量的有机酸标样，分别测定三份样本，计算各酸的回收率。

2 结果与分析

2.1 三种有机酸测定的标准色谱图、回归分析、精密度与回收率

在给定的色谱条件下，对三种有机酸混合标准溶液进样分析，20 min得到了标准品色谱图见图1。乳酸、乙酸、柠檬酸的保留时间分别为5.90、6.78、9.53，在该色谱条件下，三种有机酸得到了有效分离，峰形较好。但在3 min处有一本底杂峰见图1。

图1 乳酸、乙酸、柠檬酸标准混合样本的色谱检测图

结果显示见表2，三种有机酸的相关系数在0.998 7～0.999 0，峰面积和有机酸浓度线性相关性较好；三种有机酸的RSD范围在1.77%～2.32%，精确度较高；回收率在92.53%～102.14%，回收率较高。

2.2 草莓果实与草莓果酒中三种有机酸定量分析

对草莓果汁有机酸的高效液相色谱分析显示，柠檬酸是草莓果实中最主要的有机酸，含少量乳酸，不含乙酸见图2，表3。利用RW酵母菌种发酵得到的草莓果酒（酒样1）中，出现了少量乙酸（0.41 g/L），柠檬酸含量相较于草莓果实无明显变化见图3，表3、乳酸含量由0.67 g/L降至0.25 g/L。利用RW酵母菌种发酵得到的草莓果酒经陈酿后（酒样2），柠檬酸略有降低（12%），乙酸含量无明显变化，但乳酸含量明显升高，达3.02 g/L，分别为草莓果实与酒样1的4.5倍、12.08倍见图4，表3。

图3 酒样1中三种有机酸的高效液相色谱检测图

图4 酒样2中三种有机酸的高效液相色谱检测图

而利用自然发酵得到的草莓果酒（酒样3）中三种有机酸的含量发生了明显改变。其中柠檬酸含量大幅降低，分别为草莓果汁、酒样2、酒样3的40%、35%、39%。乳酸含量出现大幅上升，分别为草莓果汁、酒样1、酒样2的16.2倍、43.4倍、3.6倍。此外，自然发酵得到的草莓果酒（酒样3）中，乙酸含量也明显上升，分别为酒样1与酒样2的11.5倍、11.8倍见图5，表3。

图5 酒样3中三种有机酸的高效液相色谱检测图

表3 三种有机酸在草莓果实与草莓果酒中的含量

此外，仔细对比草莓汁、酒样1、酒样2、酒样3的色谱图发现，除了柠檬酸、乙酸、乳酸的三个色谱峰外，不同发酵工艺制得的果酒，其他色谱峰也发生了一定变化见图2～5，总体表现为降低的趋势。

3 讨论

通过对发酵前后草莓果实与草莓果酒中三种有机酸的定量分析发现，不同发酵工艺、发酵菌种及陈酿处理，对果酒中有机酸的种类、含量及果酒品质均有较大的影响。

本研究发现，在草莓果实中，柠檬酸是最主要的有机酸，还含有少量乳酸（0.67 g/L）及其他有机酸（见图2，保留时间10～13 min范围内）。但当使用安琪RW酵母进行发酵时（酒样1），草莓果实与草莓果酒中的柠檬酸含量在发酵前后并无明显变化（图2，3），乳酸含量降低至0.25 g/L，其他有机酸含量也显著降低（见图3，保留时间10～13 min范围内），且基本无其他新的有机酸大量产生。这使得发酵后果酒中的有机酸呈现出单一化的趋势，即柠檬酸占绝对优势。这很可能是RW酵母发酵的草莓酒出现口感偏酸、口感寡淡的主要原因（表1）。这表明酵母菌在果酒发酵过程中，可通过对有机酸代谢的选择性，改变草莓果酒中有机酸含量及比例，进而影响果酒感官品质。因此，安琪RW酵母可能不是酿造草莓果酒的最佳菌种。Misanovic[15]与Wiriyacharee[16]等对草莓果酒的研究也发现，酵母菌种是影响草莓果酒的品质的重要因素之一。这表明，有针对性的选择或选育可代谢柠檬酸或可以丰富果酒中有机酸的草莓酒专用菌种，是提升草莓果酒品质的有效途径。

相较于酒样1，经过6个月陈酿后（酒样2），果酒中柠檬酸含量略有降低（12%），乙酸含量变化不大，乳酸含量大幅上升（酒样1的7.55倍），但香气明显改善（表1）。目前对葡萄酒的研究表明，酒精发酵结束后，酒中常含有柠檬酸及残糖（葡萄糖、果糖及阿拉伯糖等）。乳酸菌可以将柠檬酸分解代谢生成乳酸以及双乙酰、乙偶姻等风味物质，对葡萄酒的感官品质具有重要影响[14]。这表明草莓酒后期陈酿过程中，可能有乳酸菌的参与，由于草莓酒中有机酸主要是柠檬酸，这很可能是陈酿后酒体（酒样2）乳酸含量增加、香气发生明显改善的原因之一。这也从另一个方面证实了Sharma和Joshi[17]的研究，即：不管是哪一个草莓品种或使用哪一种酿造方法，陈酿后熟都能提高草莓酒的感官品质。但草莓酒香气的改善是否还有其他微生物的参与（如产酯酵母等）还需进一步研究。

此外，与RW酵母发酵的酒样1、2相比，自然发酵的草莓酒（酒样3）酒体中有机酸含量变化也最为剧烈（图5，表3），其酒体也具有区别于酒样1、2的显著特点。这很可能是由于草莓发酵前未经SO2杀菌处理，除各种天然酵母菌外，还引入了醋酸菌、乳酸菌及其他细菌，从而导致发酵过程中及陈酿过程中产生大量乳酸、乙酸（表3）及其他代谢物，并使柠檬酸含量大幅降低，从而赋予其独特的香气与醇厚的口感。这表明，草莓果实上附着的乳酸菌、醋酸菌及其它微生物可能在草莓酒酿造及风味形成过程中发挥着特殊的作用。因此，深入研究草莓酒自然发酵过程中微生物种群及其动态变化，分析其对果酒品质的影响，进而从中分离优良发酵菌株，弥补单一菌种发酵口感寡淡的缺陷，对草莓酒的工业化生产同样具有重要意义。

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The quantitative analysis of three kinds of organic acids in strawberry fruit and strawberry wine before and after fermentation

ZHANG Yuan1,ZHANG Xin-hong1,LAN Wei2,GUO Bin1,WANG Ming-yue1,LIU Wen-fu3
(1.Department of Biology Engineering,Fuyang Institute of Technology,Fuyang Anhui236000,China;2.School of Biology and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;3.Hongfu Agricultural Technological Co.Ltd,Fuyang Anhui236000,China)

The quantitative analysis of three kinds of organic acids in strawberry fruit and strawberry wine made by fermentation was investigated by HPLC to study their metabolic changes before and after fermentation.The main result is as follows: (1)The separation was performed on the C18[4.6 mm×250 mm I.D5μm]column.The mobile phase were 0.01 mol/L KH2PO4 (pH=2.28)and methanol(98∶2)with flow rate of 1 mL/min,detection wavelength of 210 nm,injection volume of 20 μL,and quantitative analysis by external standard law.Under the detection conditions,three organic acids(citric acid,acetic acid and lactic acid)in strawberry juice and wine could be successfully separated and determined with good linear relationship and high sensitivity.(2)HPLC chromatographic analysis showed that the citric was the main organic acid in strawberry fruit.However,the citric was hardly metabolized during the fermentation of strawberry fruit when using RW yeast of Angel Co.,Ltd.More significantly,there was almost no other new organic acid generated in large amounts in this process.As a result,the citric became thedominant organic acid in strawberry wine,which gave the wine a bland flavor.(3)The metabolism of citric by lactobacillus may exist during the aged strawberry wine,leading to the increase of lactic acid and fragrance improvement of the strawberry wine. (4)In the strawberry wine produced by wild fermentation,the content of acetic acid and lactic acidrose significantly,but the content of citric acid reduced dramatically.In addition,the strawberry wine produced by wild fermentation had rich eraroma and velvety texture.It suggested that the lactobacillus and acetic acid bacteria may have a special effect on the vinification of strawberry wine.However,because the total acid is too high,the wine tastes too sour,which become an urgent problem to be solved in the following research.

strawberry;strawberry wine;HPLC;organic acid;citric acid;acetic acid;lactic acid;quantitative analysis

TS262.7，TS261.4

A

1004-4329（2017）01-051-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）01-051-05

2016-11-15

安徽省科技攻关计划项目（1604g0702059）；安徽省教育厅自然科学研究重点项目（KJ2016A566）资助。

张源（1977-），男，博士，讲师，研究方向：微生物发酵工程、微生物遗传育种。