外周血CPNE3表达异常可能作为评估稳定冠心病发展为急性心肌梗死的遗传标志

王 孟，谭卜川，杨玉双，刘 龙，刘雪岩，孟繁波

(1.吉林大学临床医学院 2013级临床五班，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 心血管内科，吉林 长春130033)

外周血CPNE3表达异常可能作为评估稳定冠心病发展为急性心肌梗死的遗传标志

王 孟1，谭卜川2*，杨玉双2，刘 龙2，刘雪岩2，孟繁波2*

(1.吉林大学临床医学院 2013级临床五班，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 心血管内科，吉林 长春130033)

基因COPINE III可能和一种具有内在激酶活性的磷蛋白有关，属于一类非传统的激酶家族[1]。CPNE3基因相较在稳定冠心病(SCAD)患者中比在急性心肌梗死(AMI)患者中差异性低表达，表达倍数为0.484倍[2]。本研究欲通过扩大临床资料样本量的方法，来进一步验证CPNE3基因是否能预测AMI发生，并评估CPNE3基因外周血表达量对于AMI的诊断价值以及外周血CPNE3基因表达产物是否可作为急性心梗风险评估的生物标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年4月-2016年11月于吉林大学中日联谊医院心血管内科住院治疗并行冠脉造影术的患者，依据2012年公布的心肌梗死全球统一定义[3]明确诊断为AMI的病人 91 例为AMI组，SCAD[4]患者87例为对照组。排除标准：①和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植术(CABG)相关的心肌梗死。②MI type II。继发于供血失衡相关的心梗：如儿茶酚胺水平升高或冠脉痉挛导致的心梗。③伴有心脏手术或非心脏手术的心梗。④合并多因素或不确定疾病的心肌损伤。⑤患有免疫系统疾病和(或)正在服用激素。⑥(活动性或潜伏性)结核感染史或证据。⑦正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史。⑧合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者。⑨临床资料或者冠脉造影资料不全者。详细记录临床资料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、静息血压、体质指数(BMI)、冠心病家族史、吸烟史、冠状动脉造影资料，以及合并其它临床疾病情况(如高血压、糖尿病)等。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集、总RNA提取及cDNA合成 留取各研究对象晨起空腹外周静脉血4 ml，利用血液总 RNA 提取试剂盒(RNAsimple TotalRNA Kit,天根生化科技有限公司，北京)，依据试剂盒说明书对已获取的外周血进行总 RNA提取，并利用 1.5%琼脂糖电泳及紫外分光光度计(Nanodrop 2000)对RNA的质量及浓度进行检测。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测 利用SYBR荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa,大连)进行PCR扩增。依据试剂盒说明书应用 Mx3005P 实时荧光定量PCR系统(Strata Gene)扩增。反应条件为95℃预变性1 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环，反应结束之后， 记录60℃-95℃温度范围内的熔解曲线及扩增曲线，产物4℃保存 备用。每个样本所得循环阈值(Ct)以相对表达量 2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值)，并进行比较。急性心肌梗死组对于对照组的相对表达量以 2-△△Ct法进行统计分析[5]，△△Ct=急性心肌梗死组△Ct-稳定冠心病组△Ct。所用 PCR 引物根据 NCBI 数据库提供的CPNE3基因序列进行设计，并由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

Fa,sequence from sense strands.Rb,sequence from anti-sense strands.

1.3 统计学分析

1.4 伦理声明

本研究由吉林大学中日联谊医院伦理委员会批准。所有受试者的样本及信息采集均通过受试者同意，并签署知情同意书。

2 结果

2.1 临床资料分析

研究对象的临床资料分析结果表明：在性别、 BMI、高血压病史、冠心病家族史、收缩压、舒张压及血清甘油三酯水平(TG)、血清总胆固醇水平(TC)、低密度脂蛋白胆固醇水平(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等方面，两组未见明显统计学差异。AMI组患者年龄明显高于SCAD组，差异有统计学意义，详见表 2。

表2 AMI组与SCAD组临床资料比较

2.2 CPNE3基因实时荧光定量 PCR 扩增产物鉴定

外周血 RNA 实时荧光定量 PCR 检测结果显示：CPNE3基因扩增曲线为显著平滑的“S 型”。溶解曲线呈现单一的溶解峰，扩增产物特异性较高。

2.3 CPNE3 基因 mRNA水平相对表达量在AMI组和SCAD组间比较分析

RT-PCR 所得每个样本的ΔCt 值均为单个样本重复3次测量所得均值。结果显示，AMI组 2-△Ct为 0.020(0.016-0.032)，SCAD组2-△Ct为0.029(0.021-0.067)，两组差别有显著统计学差异(Z=-4.231，P=0.000)。AMI患者外周血中CPNE3基因mRNA相对表达量明显低于SCAD患者，且其相对表达量为SCAD组的0.69倍。详见图1。

2.4 外周血CPNE3基因蛋白水平表达结果分析

本研究中以β-actin 为内参基因，对患者外周血进行蛋白水平的检测。Western Blot 结果显示：AMI组与SCAD组在β -actin 基因蛋白水平表达上无明显差异，而在CPNE3基因蛋白水平表达上差异显著，与SCAD患者相比，AMI患者在蛋白水平为低表达，AMI组CPNE3蛋白表达为SCAD组的 0.356倍，详见图2。

2.5 CPNE3基因相对表达量与年龄、血清血脂、血糖等的相关性分析

本组资料表明，CPNE3基因的mRNA水平表达量、患者年龄在AMI和SCAD两组比较均存在差异性。进一步分析CPNE3基因mRNA表达量与患者年龄、空腹血糖、血清血脂水平是否有关。将所有纳入的研究对象依据血脂水平分层标准[6]分为：TC 正常组(<5.18 mmol/L)和TC 升高组(≧5.18 mmol/L)、TG正常组(<1.76 mmol/L)、TG升高组(≧1.76)、LDL-C正常组(<3.37 mmol/L)和LDL-C 升高组(≧3.37 mmol/L)、HDL-C正常组(≧0.907)、HDL-C降低组(<0.907)。依据空腹血糖标准水平[7]将所有研究对象分为：血糖正常组(≤6.0)、血糖升高组(>6)。依据所有研究对象以年龄做AMI的ROC曲线的cut off值将所有纳入的研究对象分为：高龄组(>66.5岁)和 低龄组(≤66.5岁)。每个研究对象CPNE3基因mRNA水平的相对表达量以2-△Ct表示，分别比较各组间 与CPNE3基因表达量的相关性。结果显示：CPNE3基因mRNA表达量在高龄组与低龄组之间有差异(P=0.008)；CPNE3基因mRNA表达量与血清血脂、血糖均无关。结果详见表3。

2.6 采用 Logistic 回归分析 CPNE3基因mRNA水平表达量及患者年龄与急性心肌梗死的关系

按CPNE3 基因的相对表达量cut off值将所有研究对象分为高表达组(2-△Ct>0.013)和低表达组(2-△Ct≤0.013)，进一步采用逐步二元 Logistic 回归分析CPNE3基因mRNA水平表达量、患者年龄与AMI的相关性。结果表明：CPNE3基因低表达、患者高龄是AMI的独立危险因素，与CPNE3高表达相比，CPNE3基因低表达组AMI的风险增加2.845倍，高龄使AMI风险增加了1.605倍。详见表4。

表3 CPNE3基因mRNA表达量与患者年龄相关性分析

表4 急性心肌梗死独立危险因素logistic回归分析结果

2.7 CPNE3基因相对表达量在急性心肌梗死诊断中的ROC曲线和cut off值

根据急性心肌梗死组和对照组各样本实时荧光定量 PCR 所得CPNE3相对表达量 2-△CT值绘制 ROC 曲线，见图3。从图3可知 CPNE3基因的相对表达量对急性心肌梗死的诊断具有一定的参考价值，曲线下面积(AUC)为0.684±0.040。以约登指数最大值确定的 CPNE3基因相对表达量cut off值0.024，诊断AMI的敏感度为0.690，特异性为0.648，阳性预测值68.6%，阴性预测值65.2%。

2.8CPNE3基因相对表达量与冠状动脉病变严重程度的相关性分析

根据冠状动脉造影结果，按照Gensini评分系统对所有研究对象冠状动脉病变严重程度进行评分[8]。分值越高代表冠状动脉狭窄越重。所有研究对象Gensini评分结果为25(9.5-52)，对CPNE3基因和Gensini分值进行双变量相关分析，结果显示：CPNE3基因mRNA表达量与Gensini分值呈显著负相关(rs=-0.200，P=0.018)，即CPNE3基因mRNA的相对表达量越低，Gensini分值越高，冠状动脉病变则越重。

2.9CPNE3基因的相对表达量与心肌肌钙蛋白I(TnI)的相关性

急性心肌梗死组心肌肌钙蛋白检测结果为0.790(0.138-8.760)ng/ml。血清肌钙蛋白I(TnI)浓度的高低反应了急性心肌梗死范围的大小。血清TnI和CPNE3基因相对表达量的双变量相关分析结果显示：外周血中CPNE3基因表达量与血清TnI浓度无关(rs=-0.144，P=0.364)。即CPNE3基因mRNA水平表达量与心肌梗死的范围无关。

2.10CPNE3基因相对表达量与急性心梗患者发病距采血时间的相关性

以急性心肌梗死患者过去一周内初发的长时间(≥20min)静息痛作为发病时间点，急性心肌梗死组患者发病距采血的时间即为发病时间，结果为24(11-72)h。CPNE3基因相对表达量和急性心肌梗死发病时间相关分析结果显示：外周血中CPNE3基因表达量与急性心肌梗死发病时间长短无关(rs=-0.098，P=0.533)

3 讨论

本研究发现，与SCAD患者相比，AMI患者外周血CPNE3基因表达量无论在mRNA水平还是在蛋白表达水平均为低表达。Copine家族在细胞中的具体作用尚不明确，也有些证据显示其可能参与了膜蛋白、脂质以及其他活动[9]。近来，多有报道关于CPNE3在癌症中的作用，尤其是促使癌细胞迁移[10]。CPNE3与ErbB2相互作用促进肿瘤转移，其在非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢肿瘤中均发挥作用[10-12]。CPNE3还被证实和精神分裂症有关[13]。但是并没有关于CPNE3在心血管疾病的发生和发展中作用的研究。本研究在前期工作基础之上，进一步扩大样本量验证了CPNE3基因在急性心肌梗死患者外周血中无论mRNA水平还是蛋白质水平均为低表达。

虽然通路分析显示，CPNE3基因广泛参与着免疫调节，中性粒细胞脱颗粒，包括脂肪酸、甘油三酯、胆固醇等脂质、脂蛋白和酮体等的代谢(fromREACTOME)。但是根据本组资料显示，CPNE3基因的低表达和血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇并无相关性。故其促进AMI的机制可能并非是通过影响血脂、血糖代谢。

尽管不明确CPNE3基因促使AMI发生的发病机制。但本实验进一步通过二元Logistic回归分析结果表明，CPNE3基因低表达是AMI的独立危险因素，CPNE3基因低表达使SCAD患者患AMI的风险增加2.845倍，患者高龄是AMI独立危险因素，使AMI风险增加了1.605倍。

用CPNE3基因mRNA表达量来做ROC曲线结果表明：外周血CPNE3基因mRNA表达量可以用于诊断稳定冠心病发展为急性心梗的遗传标志物，诊断AMI的敏感度为0.690， 特异性为0.648，阳性预测值68.6%，阴性预测值65.2%。因此CPNE3基因做为诊断AMI的生物标记有一定的价值。

本研究结果还表明，CPNE3基因相对表达量与冠状动脉病变严重程度Gensini评分有关。Gensini评分应用定量冠状动脉造影的方法，测定病变严重程度，对于不同病变程度采用不同的权重，评分的高低主要与冠状动脉狭窄程度及供血范围相关[16]。即CPNE3基因的相对表达量越低，Gensini分值越高，则冠状动脉病变越重。因此，依据本研究可以推测，CPNE3基因表达量与冠状动脉病变严重程度有关。

CPNE3基因表达量与心肌肌钙蛋白I(TnI)的相关性分析证实CPNE3基因的表达量与心肌肌钙蛋白的量无关，而心肌肌钙蛋白的量反映心肌梗死的范围，所以CPNE3基因的表达量可能与心肌梗死面积大小无关。同时本研究还表明CPNE3基因表达量与急性心肌梗死发病时间无关。发病时间即患者急性心肌梗死发病距采血的时间。一般认为：如果CPNE3基因的低表达是伴随急性心肌梗死发生的，那么CPNE3基因的表达量会与心肌肌钙蛋白I(TnI)浓度及AMI发病时间均有相关性。如果CPNE3基因低表达是导致急性心肌梗死的病因之一，那么CPNE3基因的表达量会与心肌肌钙蛋白I(TnI)浓度及AMI发病时间均无相关性。

故通过本研究结果，我们可以合理推测，CPNE3基因低表达可能通过影响冠状动脉病变，促进了急性心肌梗死的发生。如果想要完全明确CPNE3基因低表达是否为急性心肌梗死的病因之一，尚需设计前瞻性研究来回答这一问题。至少通过本研究证明，CPNE3并非通过影响空腹血糖、血清TC、TG、LDL-C水平促进AMI发生。为明确CPNE3基因与糖代谢和脂类代谢以及进一步的急性心肌梗死关系，有待对CPNE3基因的生物学功能进一步明确。

结论：与SCAD患者相比，AMI患者外周血CPNE3基因低表达。CPNE3基因低表达是稳定型冠心病向急性心肌梗死进展中的独立危险因素，CPNE3基因的低表达使AMI的风险增加了2.845倍。外周血CPNE3基因mRNA表达量可以用于诊断为急性心梗的遗传标记。CPNE3基因可能是通过影响冠状动脉血管，促进了急性心肌梗死的发生，CPNE3基因是促进稳定冠心病患者发生急性心肌梗死的重要遗传因素之一。

致谢：感谢吉林大学畜牧兽医学院赵志辉教授及其团队对本研究提供的技术指导。

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新世纪优秀人才支持计划(2008)；吉林省科技厅资助(20090734)；吉林省财政厅资助(2012009)

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1366-06

2017-02-26)