破壁灵芝孢子粉对ConA诱导免疫性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST水平及肝组织炎症程度的影响

赵燕平冯彩珠付昌隆华海燕

破壁灵芝孢子粉对ConA诱导免疫性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST水平及肝组织炎症程度的影响

赵燕平1冯彩珠2付昌隆2华海燕3

目的探讨破壁灵芝孢子粉对ConA诱导免疫性肝损伤模型小鼠血清谷丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平及肝组织炎症程度的影响。方法雄性Balb/c小鼠随机分成正常组10只，模型组、低剂量破壁灵芝孢子粉组（低灵组）、高剂量破壁灵芝孢子粉组（高灵组），各12只。除正常组外，其余各组用ConA 5mg/kg尾静脉注射，隔天1次，共2周，建立免疫性肝损伤小鼠模型。正常组和模型组小鼠分别用等容量生理盐水灌胃，低灵组及高灵组小鼠分别给予破壁灵芝孢子粉1.0g/kg、2.0g/kg灌胃。4周后检测各组小鼠血清ALT、AST水平及观察肝组织炎症程度。结果低灵组、高灵组小鼠血清ALT、AST水平明显低于模型组[ALT：（129.62±44.65）U/L、（92.76±33.78）U/L比（201.78±62.47）U/L，P＜0.05；AST：（134.38±42.67）U/L、（101.76±34.56）U/L比（223.63±77.31）U/L，P＜0.05]；高灵组小鼠血清ALT、AST水平及肝组织炎症程度明显低于低灵组（P＜0.05）；低灵组及高灵组小鼠肝细胞变性、坏死及炎症细胞浸润程度比模型组明显减轻（P＜0.05）；结论破壁灵芝孢子粉能改善ConA诱导免疫性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST水平及肝组织炎症程度。

小鼠；ConA；免疫损伤；破壁灵芝孢子粉；ALT；AST；肝组织炎症

KEY WORDSmice;ConA;immune injury;broken Ganoderma lucidum spore powder;ALT;AST;inflammation of liver tissue

随着慢性乙型病毒性肝炎发病中免疫反应机制的研究深入，越来越多的学者认为机体的免疫功能低下，尤其是细胞免疫功能低下，是导致乙型肝炎病毒（HBV）感染后发病及病情向慢性化转归的重要因素，只有使机体产生有效的抗病毒免疫应答，才能真正达到临床完全控制病毒复制甚至清除病毒的目的[1-2]。现有的抗病毒药物难以达到理想的抗病毒疗效，因此寻找一种安全有效的免疫调节剂成为慢乙肝临床治愈的突破口。ConA是诱导免疫性肝损伤的经典试剂，其作用机制与T细胞和KC细胞相关，与人类慢性肝炎发病机制非常相似[3-4]。破壁灵芝孢子粉是一种珍贵的药用真菌，具有免疫调节及保肝解毒作用。为探讨破壁灵芝孢子粉是否对慢性肝炎存在免疫调节作用，本研究采用刀豆蛋白A（ConA）造模，破壁灵芝孢子粉干预，观察模型小鼠血清谷丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平及肝组织炎症程度变化，以期为慢性乙型病毒性肝炎的破壁灵芝孢子粉治疗慢性乙型病毒性肝炎提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物采用清洁级Balb/c雄性小鼠46只，体质量20～30g，6～8周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（泸）2013-2016，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境内，使用许可证号SYXK（浙）2013-0184，环境温度（23±1）℃，相对湿度50%～65%，饲喂全价营养颗粒饲料，自由饮水。

1.2 药物和试剂破壁灵芝孢子粉（寿仙谷药业公司生产），使用时用生理盐水调配成两种浓度备用：低剂量组0.1g/mL和高剂量组0.2g/mL；刀豆蛋白A（ConA）购自Sigma公司（C2010，批号80M7680V），使用时溶于生理盐水；谷丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂购自德国DiaSys DiagoticsSystemsGmbH（批号分别为07235/ 00002244、07218/00001951）。

2 实验方法

2.1 分组造模与给药将46只Balb/c雄性小鼠正常饲养1周后用随机数字表法分为四组：正常组10只，模型组、低剂量破壁灵芝孢子粉组（低灵组）和高剂量破壁灵芝孢子粉组（高灵组）各12只。正常小鼠正常饲养。模型组及低灵组、高灵组小鼠给予ConA 5mg/kg尾静脉注射，隔天1次，共2周。造模成功后，正常组及模型组予生理盐水0.1mL/10g灌胃，低灵组和高灵组分别用破壁灵芝孢子粉以1.0g/kg及2.0g/ kg灌胃，共4周。

2.2 血清ALT、AST检测4周后摘除小鼠眼球取血，检测ALT、AST水平，由浙江中医药大学动物实验中心协助完成。

2.3 肝组织病理学检查取小鼠肝组织经固定、包埋、切片、染色后镜检，由浙江中医药大学动物实验中心病理室及解放军117医院病理科协助完成。肝组织炎症活动度积分标准按王泰龄等方案[5]。

2.4 统计学方法应用SPSS12.0软件进行统计处理，计量资料以（） 表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 破壁灵芝孢子粉对小鼠血清ALT、AST水平的影响实验过程中，由于灌胃操作失误，导致高灵组死亡2只，低灵组死亡1只。破壁灵芝孢子粉干预后，高、低灵组小鼠ALT、AST水平较模型组明显降低，高灵组较低灵组明显降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。提示破壁灵芝孢子粉可以改善ConA诱导的免疫性肝损伤。见表1。

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平比较（U/L，）

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平比较（U/L，）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与低灵组比较，▲P＜0.05；ALT：谷丙氨酸转氨酶；AST：门冬氨酸氨基转移酶

组别正常组模型组高灵组低灵组鼠数10 12 10 11 ALT 67.45±23.46 201.78±62.47* 92.76±33.78△▲129.62±44.65△AST 86.45±28.76 223.63±77.31* 101.76±34.56△▲134.38±42.67△

3.2 破壁灵芝孢子粉对小鼠肝组织炎症程度的影响光镜下观察显示，正常组小鼠肝小叶清晰,肝索呈放射状排列，规则有序，肝窦未见异常；模型组小鼠肝组织均出现明显病变，肝小叶结构严重破坏，肝细胞普遍变性，混浊肿胀，胞浆疏松，部分呈气球样变，可见明显的点、灶状坏死，汇管区淋巴细胞和单核细胞炎性浸润尤为明显；低灵组及高灵组小鼠在肝细胞变性及坏死及炎细胞浸润较模型组明显减轻（P＜0.05）；高灵组小鼠肝细胞变性及坏死较低灵组明显减轻（P＜0.05）。见表2、插页图1～4。

表2 各组小鼠肝组织炎症程度比较（）

表2 各组小鼠肝组织炎症程度比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与低灵组比较，▲P＜0.05

组别正常组模型组高灵组低灵组鼠数10 12 10 11肝细胞坏死肝细胞变性炎细胞浸润-++-++-++ 101010 0 1 0 + 0 0 6 5 0 4 3 4 +++ 0 8* +++ 0 9* +++ 0 7* 0△▲2△0 3 2 + 0 0 6 3 0 3 1 6 0△▲0△0 0 0 + 0 0 4 5 0 5 6 6 0△0△

4 讨论

机体感染HBV后引起细胞免疫和体液免疫应答，并激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱，导致机体特异性免疫功能损伤，无法控制病毒复制和清除，致使HBV感染慢性化甚至进展为肝硬化、肝癌。只有使机体产生了有效的抗病毒免疫应答，才能真正达到临床完全控制病毒复制甚至清除病毒的目的，但是现有的抗病毒药物未能达到理想的抗病毒疗效。目前，临床上应用较多的慢性乙型病毒性肝炎免疫调节剂主要有胸腺肽、治疗性乙肝疫苗、重组细胞因子等[6-7]，以上免疫调节治疗疗效肯定，但价格昂贵、注射不便导致依从性差，且很多免疫细胞因子治疗局限在动物实验或小样本临床研究，目前难以普及。

灵芝，又称“仙草”，是一种珍贵的药用真菌。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的淡雾状的极其微小的孢子，孢子内含有比灵芝更丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶类、硒元素等特殊成分物质,具有免疫调节、保肝解毒、抗肝纤维化、抗肿瘤、抗病毒等许多药理作用[8]。诸多研究[9-10]提示，破壁灵芝孢子粉可调节小鼠的细胞免疫和体液免疫功能，并能有效增强小鼠NK细胞活性和单核—巨噬细胞吞噬功能，且效果较未破壁灵芝孢子粉好。

刀豆蛋白A（ConA）诱导的肝损伤是模拟与免疫相关肝病研究T细胞依赖的最好模型之一,其特点是白细胞分化抗原4（CD4+）T细胞增多所介导，与慢性乙型病毒性肝炎发病的免疫反应机制相似。我们以ConA诱导小鼠为模型，观察破壁灵芝孢子粉干预后的血清ALT、AST及肝组织炎症程度的变化，发现药物干预后小鼠血清ALT、AST水平较模型组明显降低，且高剂量组护肝效果优于低剂量组，药物干预后的肝组织内炎症程度也较模型组明显改善，但高、低灵组之间炎症改善差别不明显。说明破壁灵芝包子粉可以改善ConA诱导的小鼠免疫损伤，降低血清ALT、AST水平，且护肝效果随剂量增大相应增强。

［1］王福生，张政.宿主免疫状态决定慢性乙肝的转归和临床疗效［C］.第六届全国免疫学术大会论文集.2008：38-40.

［2］曾跃红，田海清，王新华，等.乙型病毒性肝炎临床转归与机体细胞免疫功能状况的相关性研究［J］.中国医药导报，2015，12（5）：8-11，21.

［3］Elmar J.Animal Models of Autoimmune Hepatitis［M］.Mackay IR，Rose NR，Ledford DK，et al.Encyclopedia of medical immunology.Springer：New York，2014：325-337.

［4］Shao X，Qian Y，Xu C，et al.The protective effect of intrasplenic transplantation of Ad-IL-18BP/IL-4 gene-modified fetal hepatocytes on ConA-induced hepatitis in mice［J］.PLoS One，2013，8（3）：e58836.

［5］王泰龄，刘霞，周元平，等.慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度积分方案［J］.中华肝脏杂志，1998，6（4）：195-197.

［6］张旋，左维泽，买力坎木，等.阿德福韦酯联合胸腺肽治疗拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者前后IL-10和IL-18的变化及意义［J］.吉林医学，2013，34（28）：5798-5800.

［7］操跃.慢性乙型肝炎的抗病毒研究进展［J］.药学实践杂志，2015，33（6）：561-565.

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［9］杨隽，帅怡，肖萍，等.灵芝破壁抱子粉对小鼠免疫功能影响的实验研究［C］.第四届第二次中国毒理学会食品毒理学专业委员会与营养食品所毒理室联合召开学术会议论文集，2008：240-244.

［10］黄梅.灵芝制剂对小鼠免疫功能调节作用的研究［D］.吉林大学，2012.

（收稿：2017-04-11 修回：2017-05-14）

Effect of Broken Ganoderma Lucidum Spore Powder on Serum ALT,AST Levels and Liver Inflammation in Mice with ConA-induced Immune Injury

ZHAO Yanping1,FENG Caizhu2,FU Changlong2,HUA Haiyan3.1

Department of Infectious Disease,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China;2 The First College of Clinical Medicine,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Department of Pathology, the 117th Hospital of PLA,Hangzhou(310007),China

ObjectiveTo investigate the effect of broken Ganoderma lucidum spore powder on serum ALT,AST levels and liver inflammation in mice with ConA-induced immune injury.MethodsBalb/c male mice were randomly divided into 4 groups∶normal group（n=10）,model group（n=12）,low dose group（with 1.0g/kg broken Ganoderma lucidum spore powder,n=12）and high dose group（with 2g/kg broken Ganoderma lucidum spore powder,n= 12）.Except normal group,the immune damage model was established by intravenous injection of ConA（5mg/kg）for 2 weeks.Normal group and model group were treated with normal saline.After 4 weeks,the levels of ALT, AST and the degree of liver inflammation were observed.ResultsThe ALT and AST levels of low dose group and high dose group were significantly lower than those of model group（ALT∶129.62±44.65U/L,92.76±33.78U/L vs 201.78±62.4U/L,P＜0.05;AST∶134.38±42.67U/L,101.76±34.56U/L vs 223.63±77.31U/L,P＜0.05）;the levels of ALT,AST and the inflammation of liver tissue in high dose group were lower and milder than those of low dose group（P＜0.05）.The degree of liver cell degeneration，necrosis and inflammation of low dose group and high dose group were significantly milder than those model group（P＜0.05）.ConclusionBroken Ganoderma lucidum spore powder can improve the level of serum ALT,AST and inflammation of liver tissue in mice with ConA-induced immune injury.

book=760,ebook=29

浙江省自然科学基金青年科学基金项目（No.LQ14H90005）

1浙江省中医院感染科（杭州310006）；2浙江中医药大学第一临床医学院（杭州310053）；3中国人民解放军117医院病理科（杭州310007）

赵燕平，Tel：15924186653；E-mail：xiaoke_bao_a@163.com