桔梗皂苷D对肝癌干细胞活力和细胞凋亡的干预作用及其机制研究

宣丽杨

桔梗皂苷D对肝癌干细胞活力和细胞凋亡的干预作用及其机制研究

宣丽杨

目的探讨桔梗皂苷D对肝癌干细胞活力和细胞凋亡的干预作用及其机制。方法MTT法和Annexin V染色流式细胞术检测桔梗皂苷D和5-氟尿嘧啶对HepG2肝癌干细胞细胞活力和细胞凋亡的影响；采用Western blot检测HepG2肿瘤干细胞HAX1表达；运用JC-1染色流式细胞术、Annexin V染色流式细胞术及Western blot方法研究桔梗皂苷D联合5-氟尿嘧啶对肝癌干细胞凋亡通路的影响。结果5μmol/L 5-氟尿嘧啶处理下HepG2肿瘤干细胞活力抑制率为（29.1± 2.4）%，显著低于常规HepG2细胞活力抑制率（72.7±5.2）%（P＜0.05）。5-氟尿嘧啶联合桔梗皂苷D对HepG2肿瘤干细胞的细胞活力抑制率为（66.7±3.4）%，凋亡诱导率为（33.9±2.1）%，显著高于5-氟尿嘧啶单独处理的细胞活力抑制率[（28.7±1.8）%，P＜0.05]和凋亡诱导率[（8.9±0.6）%，P＜0.05]。桔梗皂苷D处理后HepG2肿瘤干细胞HAX1相对表达水平比对照组显著下降[（0.24±0.02）比（0.78± 0.05），P＜0.05]；5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1质粒组HepG2肿瘤干细胞凋亡率显著低于5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组[（10.1±0.7）%比（34.8±2.2）%，P＜0.05]；5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组HepG2肿瘤干细胞相对线粒体膜电位显著低于5-氟尿嘧啶组[（0.21±0.02）比（0.84±0.04），P＜0.05]。结论桔梗皂苷D可能通过下调HAX1表达抑制肝癌干细胞对5-氟尿嘧啶的抵抗性。

肝癌干细胞；HAX1；线粒体；凋亡；桔梗皂苷D；5-氟尿嘧啶

文献[1-2]报道，肿瘤干细胞（tumor stem cells，TSCs）对化疗存在抵抗性，是导致肿瘤复发的重要因素。肝癌是常见的消化系统肿瘤之一，恶性程度高，患者预后往往不良，五年存活率较低[3]。5-氟尿嘧啶是治疗肝癌的重要化疗药物，然而5-氟尿嘧啶的长期治疗往往造成肿瘤细胞对其发生抵抗[4]，因此抑制肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性具有十分重要的意义。本文旨在研究桔梗皂苷D对肝癌干细胞细胞活力和细胞凋亡的干预作用及其机制研究。

1 材料与方法

1.1 材料DMEM培养基购于美国Gibco。噻唑蓝（MTT）、桔梗皂苷D和5-氟尿嘧啶购于美国Sigma-Aldrich。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（货号：88-8005-72）购于美国ebioscience。造血细胞特异性蛋白相关蛋白1（HAX1）抗体、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）抗体和β-肌动蛋白（β-actin）抗体购于美国CellSignaling。JC-1（5，5′，6，6′-Tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl imidacarbo cyanine iodide）染料购于美国Molecular Probes。CD133-FITC荧光抗体购于美国BD公司。增强型化学发光底物（ECL）试剂盒（货号：32106）购于美国Pierce。脂质体2000（Lipofectamine 2000）购于美国Invitrogen。

1.2 细胞培养人肝癌细胞系HepG2购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。HepG2肿瘤干细胞用流式细胞仪进行分选，CD133阳性的HepG2细胞即为HepG2肿瘤干细胞[5]。常规HepG2细胞及HepG2肿瘤干细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.3 质粒构建和转染将HAX1基因（Gene ID：NM_001018837.1）的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成HAX1重组真核表达质粒。HAX1表达质粒用Lipofectamine2000按试剂操作说明书步骤进行转染，将2μg/mL HAX1表达质粒转染入HepG2肿瘤干细胞中。

1.4 细胞活力检测将HepG2肿瘤细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、桔梗皂苷D组、5-氟尿嘧啶组、5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组和5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1质粒组。对照组为肿瘤细胞不加药物培养48h，5-氟尿嘧啶组为在肿瘤细胞中加入5μmol/L的5-氟尿嘧啶培养48h，桔梗皂苷D组为在肿瘤细胞中加入2μmol/L的桔梗皂苷D培养48h，5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组为在肿瘤细胞中加入5μmol/L的5-氟尿嘧啶和2μmol/L的桔梗皂苷D培养48h，5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1质粒组为先将2μg/mL的HAX1表达质粒转染入肿瘤细胞中培养24h，之后更换培养基再加入5μmol/L的5-氟尿嘧啶和2μmol/L的桔梗皂苷D继续培养48h。药物处理完毕后在培养体系中加入20μL 5g/L MTT再培养4h，弃去上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，在570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率计算公式：抑制率=（OD对照组-OD治疗组）/ OD对照组×100%。

1.5 细胞凋亡实验将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。处理完毕后按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中暗室孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.6 Western blot实验将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。药物处理完毕后将细胞用蛋白提取液提取总蛋白质。之后将提取的总蛋白质用12%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用HAX1抗体，cleaved Caspase-3抗体或βactin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。蛋白灰度值分析用Image J软件处理。目标蛋白的相对表达水平用它们的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.7 线粒体膜电位测定将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。处理完毕后按试剂操作说明书步骤将细胞用JC-1染料进行孵育。20min后，将细胞用生理盐水洗涤3遍，之后用流式细胞仪检测JC-1发出的红色荧光，红色荧光强度越强，线粒体膜电位越高[6]。治疗组的相对线粒体膜电位为各治疗组的JC-1荧光强度与对照组荧光强度的比值。

2 结果

2.1 各组HepG2肿瘤干细胞细胞活力抑制率与凋亡率比较MTT实验结果显示，不同浓度5-氟尿嘧啶对HepG2肿瘤干细胞的杀伤活性显著低于常规HepG2细胞（P均＜0.05），表明HepG2肿瘤干细胞对5-氟尿嘧啶有明显的抵抗性（见图1）。联用桔梗皂苷D后，5-氟尿嘧啶对HepG2肿瘤干细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性显著增强（P均＜0.05），表明桔梗皂苷D能明显抑制HepG2肿瘤干细胞对5-氟尿嘧啶的抵抗性。见表1。

图1 不同浓度5-氟尿嘧啶对常规HepG2细胞及HepG2肿瘤干细胞细胞活力的影响

2.2 各组HAX1表达水平和HepG2肿瘤干细胞凋亡率比较Western blot结果显示，桔梗皂苷D处理能显著抑制HepG2肿瘤干细胞抗凋亡蛋白HAX1表达水平（P＜0.05），而5-氟尿嘧啶对HAX1表达无影响（P＞0.05），表明HAX1可能是桔梗皂苷D作用靶点。当转染HAX1质粒后，桔梗皂苷D不能协同5-氟尿嘧啶诱导HepG2肿瘤干细胞发生凋亡（P＜0.05），表明桔梗皂苷D可能通过下调HAX1表达水平增强5-氟尿嘧啶对HepG2肿瘤干细胞的凋亡诱导活性，见表2。

2.3 各组HepG2肿瘤干细胞线粒体膜电位和Caspase-3表达水平比较流式细胞实验结果显示，联用桔梗皂苷D后，5-氟尿嘧啶对HepG2肿瘤干细胞线粒体膜电位的损伤作用明显增强（P＜0.05），Western blot结果显示，联用桔梗皂苷D能显著增强5-氟尿嘧啶对HepG2肿瘤干细胞Caspase-3活化（P＜0.05）。然而，转染HAX1质粒后，桔梗皂苷D对线粒体膜电位和Caspase-3干预作用受到明显抑制（P＜0.05）。表明桔梗皂苷D可能通过下调HAX1表达促进5-氟尿嘧啶诱导的线粒体途径的凋亡，见表3。

3 讨论

新近研究发现，肿瘤组织中的肿瘤干细胞往往对化疗不敏感，它们能通过改变自身的基因表达产生对化疗药物的抵抗性，肿瘤干细胞还有很高的自我更新能力，化疗后存活的肿瘤干细胞常导致肿瘤的复发[7-8]。桔梗皂苷D是桔梗科植物桔梗干燥根中提取的有效活性成分，具有抗炎、镇痛和免疫调节的作用。文献报道，桔梗皂苷D对多种肿瘤有一定的抑制作用，在体外能促进肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞[9-11]，然而其对肿瘤干细胞的生物活性至今却仍很少报道。本研究发现桔梗皂苷D能显著逆转肝癌干细胞对5-氟尿嘧啶的抵抗性，表明桔梗皂苷D能作为一种辅助治疗药物增强5-氟尿嘧啶对肝癌干细胞的杀伤活性，提高化疗有效率。

表1 各组HepG2肿瘤干细胞细胞活力抑制率与凋亡率比较（%，）

表1 各组HepG2肿瘤干细胞细胞活力抑制率与凋亡率比较（%，）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与桔梗皂苷D组比较，△P＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，▲P＜0.05

组别对照组桔梗皂苷D组5-氟尿嘧啶组5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组孔数5-氟尿嘧啶（μmol/L）桔梗皂苷D（μmol/L）3 3 3 3 0 0 5 5 0 2 0 2细胞活力抑制率0 5.8±0.5 28.7±1.8* 66.7±3.4△▲凋亡率1.8±0.2 2.6±0.3 8.9±0.6* 33.9±2.1△▲

表2 各组HAX1表达水平和HepG2肿瘤干细胞凋亡（）

表2 各组HAX1表达水平和HepG2肿瘤干细胞凋亡（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，▲P＜0.05；与5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组比较，#P＜0.05

组别对照组桔梗皂苷D组5-氟尿嘧啶组5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1质粒组孔数5-氟尿嘧啶（μmol/L）桔梗皂苷D（μmol/L）HAX1质粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 0 5 5 5 0 2 0 2 2 0 0 0 0 2 HAX1相对表达水平0.78±0.05 0.24±0.02* 0.80±0.05 0.25±0.02▲0.92±0.06#凋亡率（%）1.9±0.2 2.6±0.3 8.8±0.6* 34.8±2.2▲10.1±0.7#

表3 各组HepG2肿瘤干细胞线粒体膜电位和Caspase-3表达水平比较（）

表3 各组HepG2肿瘤干细胞线粒体膜电位和Caspase-3表达水平比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，▲P＜0.05；与桔梗皂苷D组比较，△P＜0.05；与5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组比较，#P＜0.05

组别对照组桔梗皂苷D组5-氟尿嘧啶组5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1质粒组孔数5-氟尿嘧啶（μmol/L）桔梗皂苷D（μmol/L）HAX1质粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 0 5 5 5 0 2 0 2 2 0 0 0 0 2相对线粒体膜电位1.00±0.05 0.94±0.04 0.84±0.04* 0.21±0.02▲△0.77±0.03#Cleaved Caspase-3相对表达水平0.01±0.01 0.03±0.01 0.09±0.02* 0.58±0.04▲△0.14±0.02#

HAX1是一种定位在线粒体外膜上的抗凋亡蛋白[12]。研究表明，HAX1过表达能阻碍肿瘤细胞的凋亡途径，抑制由药物或其他环境因素引起的肿瘤细胞线粒体的损伤，因此，包括肿瘤细胞的HAX1往往过度表达，且HAX1的过表达程度与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性呈负相关[13]。在本研究中，笔者发现桔梗皂苷D在HepG2肿瘤干细胞中的直接靶点是HAX1蛋白，桔梗皂苷D辅助治疗能显著降低HepG2肿瘤干细胞HAX1表达水平。当在肝癌干细胞中转染HAX1质粒强制增加它的表达水平后，桔梗皂苷D联合5-氟尿嘧啶对肝癌干细胞线粒体的损伤作用受到显著抑制，同时Caspase-3的活化也受到明显抑制，表明桔梗皂苷D通过抑制HAX1的表达抑制肝癌干细胞对线粒体途径凋亡的抵抗性，提高5-氟尿嘧啶对肝癌干细胞的杀伤活性。

本研究结果显示，桔梗皂苷D能显著抑制肝癌干细胞对5-氟尿嘧啶的抵抗性。其机制为桔梗皂苷D可能通过下调HAX1表达促进5-氟尿嘧啶对肝癌干细胞线粒体的损伤进而诱导肿瘤细胞发生Caspase-3依赖的凋亡。这些研究结果为逆转肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的抵抗性，提高其疗效提供新的思路和理论依据。

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（收稿：2017-02-05 修回：2017-05-20）

Intervention of Platycodin D on Viability and Apoptosis of Liver Cancer Stem Cells and Its Related Mechanism

XUAN Liyang.Department of Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the role of platycodin D in inhibiting the resistance of liver cancer stem cells to 5-fluorouracil.MethodsMTT assay and Annexin V staining were performed to investigate the effect of platycodin D and 5-fluorouracil on cell viability and apoptosis in HepG2 cancer stem cells.Western blot analysis was performed to investigate the effect of platycodin D on regulating the expression of HAX1 in HepG2 cancer stem cells.JC-1 staining,Annexin V staining and western blot analysis was performed to investigate the apoptotic pathway in HepG2 cancer stem cells treated with platycodin D and 5-fluorouracil.ResultsCell viability inhibitory rate of HepG2 cancer stem cells treated with 5mol/L 5-fluorouracil was（29.1±2.4）%,which was significantly lower than the routine HepG2 cells[（72.7±5.2）%,P＜0.05].Cell viability inhibitory rate and apoptotic rate of HepG2 cancer stem cells co-treated with 5-fluorouracil plus platycodin D were（66.7±3.4）%and（33.9±2.1）%,respectively, which were significantly higher than the cell viability inhibitory rate[（28.7±1.8）%,P＜0.05]and apoptotic rate[（8.9± 0.6）%,P＜0.05]of HepG2 cancer stem cells treated with 5-fluorouracil alone.Relative expression of HAX1 in platycodin D treatment group was significantly lower than that in control group（0.24±0.02 vs 0.78±0.05,P＜0.05）. Apoptotic rate in 5-fluorouracil+platycodin D+HAX1 plasmid treatment group was significantly lower than that in the 5-fluorouracil+platycodin D group[（10.1±0.7）%vs（34.8±2.2）%,P＜0.05];relative mitochondrial membrane potential in 5-fluorouracil+platycodin D treatment groupis significantly lower than that in 5-fluorouracil alone group（0.21±0.02 vs 0.84±0.04,P＜0.05）.ConclusionPlatycodin D may inhibit the resistance of liver cancer stem cells to 5-fluorouracil via down-regulating the expression of HAX1.

liver cancer stem cells;HAX1;mitochondria;apoptosis;platycodin D;5-fluorouracil

book=756,ebook=25

浙江省立同德医院检验科（杭州310012）