不同因素对南方红豆杉愈伤组织诱导的初步研究

王荣明，陈秋良，王 烨，吴红梅，刘人菁

（1.屏边县农广校，云南 红河 661200；2.屏边县农产品质量安全检测站，云南 红河 661200；3.红河州农广校，云南 红河 661200）

不同因素对南方红豆杉愈伤组织诱导的初步研究

王荣明1，陈秋良3，王 烨1，吴红梅2，刘人菁2

（1.屏边县农广校，云南 红河 661200；2.屏边县农产品质量安全检测站，云南 红河 661200；3.红河州农广校，云南 红河 661200）

本试验主要研究不同因素对南方红豆杉(Taxus chinensis var mairei)愈伤组织诱导的影响，通过不同的材料（幼嫩茎段、叶柄、叶、芽）、不同培养基、不同光照条件以及不同的激素配比4个方面来进行试验诱导南方红豆杉愈伤组织，旨在筛选出适合诱导南方红豆杉愈伤组织的最佳配方、适宜的培养条件和适宜的外植体。

南方红豆杉；组织培养；外植体；愈伤组织；诱导

1 前言

红豆杉属(Taxus Linn.)植物在全世界大约有11种，我国有4种1变种[1]。从红豆杉属植物中分离出来的一种抗肿瘤特效成分——紫杉醇,具有抗白血病、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌等癌症的效用[2]，因为它是一种新型、高效、广谱抗癌药物，且制剂市场前景极好，所以紫杉醇成为当今最热门的抗癌药物之一。近年来,众多学者在南方红豆杉组培微繁育苗方面进行了系统研究,并在组培微繁关键技术，如光照、温度、pH调控以及外植体选用和激素配比等方面都取得了长足的进展[3]。

本文通过不同外植体、不同培养基、不同光照条件和不同激素配比4个方面对南方红豆杉愈伤组织的诱导进行研究，旨在筛选出最适合诱导南方红豆杉愈伤组织的最佳配方、适宜的培养条件和适宜的外植体，从而能大量地诱导出愈伤组织，试图为进一步大规模细胞培养、生产紫杉醇奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料的选择

外植体采自屏边苗族自治县玉屏镇引种的南方红豆杉5年生枝条，选择当年生长健壮、无病虫害的幼嫩茎段、叶柄、叶、芽作外植体。

2.2 材料的处理

把取来的材料流水冲洗后，置于70%乙醇中浸泡数秒,再用0.2%HgCl2灭菌数分钟，无菌水冲洗3～5次,置于无菌滤纸上吸去材料表面水分,切取2～3 cm的材料供接种用。

2.3 不同材料对愈伤组织的影响因素

以MS为基本培养基，以下所有培养基均含蔗糖2.5%、琼脂0.7%,pH值5.8，培养温度为25℃左右，暗培养，每天进行观察，试验配方为：MS+6-BA 0.5 mg· L-1+NAA 1.0 mg·L-1。取南方红豆杉不同外植体材料进行试验，观察不同外植体（即叶片、芽、叶柄、幼嫩茎段）诱导愈伤组织的情况，筛选出诱导率最佳的外植体。

2.4 不同培养基对愈伤组织的影响因素

设计4种不同的培养基：MS、B5、改良怀特培养基White、TA（大量元素：KNO325 00 mg/L、NH4NO3825 mg/L、KH2PO4240 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、CaCl2·2H2O 600 mg/L，其余成分同MS），通过试验筛选出最适合红豆杉愈伤组织诱导的培养基。

2.5 不同的光照条件对愈伤组织的影响

以TA+6-BA0.5 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1为基本培养基，然后通过黑暗培养与光照培养进行对照试验，通过试验说明红豆杉的愈伤组织是适合黑暗培养还是适合光照培养，或者是适合先黑暗培养几天后转为光照培养。

2.6 不同激素对愈伤组织诱导的影响

设计4组不同的激素梯度（TA+1.0 NAA+0.5 6-BA、TA+0.5 NAA+0.05 6-BA、TA+3 NAA+2.8 6-BA+1.2 2,4-D、TA+1.0 2,4-D+0.5 6-BA），按照以上的最佳培养条件，筛选出最适合诱导红豆杉愈伤组织的最佳激素配比。

3 讨论

根据本试验的研究经过，外植体污染依次为：嫩茎段＜芽＜叶柄＜叶片；而诱导率依次为：芽＜叶片＜叶柄＜幼嫩茎段。综合上述情况,以新生幼嫩嫩茎作为外植体是较好的选择（表1）。

合适的培养基对南方红豆杉组织培养至关重要。本试验通过四种不同的培养基（MS、B5、White、TA）进行试验，得出TA培养基愈伤组织的诱导率高达96%，并且增长量最多，诱导率依次为：TA＞MS＞White＞B5（表2）。

有报道称光照条件不利于愈伤组织诱导，因为光照条件会激活红豆杉愈伤组织内的多酚氧化酶，从而促进愈伤组织褐化。暗培养可在一定程度上减轻褐变程度，同时培养温度不宜过高。温度过高可能提高PPO活性,加速褐化。本实验研究表明：黑暗条件下诱导红豆杉愈伤组织出愈时间最早且诱导率最高，依次为：黑暗培养，光照培养，先暗培养、再光照（表3）。

表1 不同材料对愈伤组织的影响因素

表2 不同培养基对愈伤组织的影响因素

表3 不同光照条件对愈伤组织的影响因素

南方红豆杉组织培养中,常用生长素有2,4-D (2,4-二氯苯氧基乙酸)、NAA(萘乙酸),常用细胞分裂素有6-BA(6-苄氨基嘌呤)、KT(激动素)。通常将生长素和分裂素配合使用,并根据培养阶段和外植体情况进行浓度配比。根据表4可得出适合诱导红豆杉愈伤组织的最佳激素配比依次为：2＞1＞3＞4。试验结果表明愈伤组织在这两种组合（0.3 NAA+0.05 6-BA）条件下生长旺盛，相对生长量大，愈伤化程度高。

表4 不同激素对愈伤组织的影响因素

4 结论

本试验通过对不同的外植体进行愈伤组织诱导后，得出红豆杉的幼嫩茎段是诱导愈伤组织的最佳材料；通过不同的培养基试验后得出TA为诱导红豆杉愈伤组织的最佳培养基，这与前人的试验想吻合；通过在不同的光照条件下得出黑暗培养最适合诱导红豆杉愈伤组织；通过4种不同的激素配比后得出，诱导红豆杉的最佳激素配比为：0.3NAA+0.05 6-BA。

综上所述，诱导红豆杉愈伤组织应该选取幼嫩茎段为试验材料，在黑暗的环境下，TA+0.3 NAA+0.05 6-BA进行培养，可以获得大量的愈伤组织，试图为进一步大规模细胞培养生产紫杉醇奠定基础。

[1]李湘萍,朱政德.红豆杉属植物的地理分布与应用前景[J].1994 (4):20-21..

[2]阎家麒,范金称,王九一.紫杉醇提取分离纯化工艺[J].中国医药工业杂志,1996,27(12):531-534.

[3]何康,樊正球,李丽,等.南方红豆杉组织培养研究进展[J].中国生态农业学报,2007, 15(5):215-218.

2017-08-15）

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1005-2690（2017）09-0137-02

S791.49

B

王荣明(1987-)，男，彝族，中级农艺师，主要从事组培育苗和农民科技教育工作；王烨(1974-)，女，汉族，中级农艺师，主要从事农民科技教育工作；吴红梅(1973-)，女，汉族，中级农艺师，主要从事农业技术的推广应用工作；刘人菁(1990-)，女，汉族，中级农艺师，主要从事农业技术的推广应用工作；陈秋良(1982-)男，彝族，农艺师，主要从事农民科技教育工作。