人脐带间充质干细胞经动脉介入治疗2型糖尿病Beagle犬的作用

董松　王鸿　雷蕾

[摘要] 目的 探討人脐带间充质干细胞（UCMSCs）经动脉介入植入对2型糖尿病Beagle犬的治疗作用。 方法 将24只Beagle犬随机分为UCMSCs治疗组（治疗组，n = 11），糖尿病模型对照组（模型组，n = 8）和正常对照组（正常组，n = 5）。治疗组和模型组高脂饲料喂养联合静脉注射四氧嘧啶建立2型糖尿病模型。治疗组进行胰岛素联合UCMSCs动脉介入治疗，模型组仅接受胰岛素治疗，正常组不接受任何治疗。荧光显微镜下观察CM-Dil标记的UCMSCs在组织中的分布，比较三组治疗前后体质量、血脂、空腹血糖、胰岛素用量、C肽曲线下面积、胰岛素分泌指数（HOMA-β），胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的变化。 结果 CM-Dil标记细胞主要分布在胰腺及肾脏内。治疗组在UCMSCs治疗后第4周空腹血糖开始下降，胰岛素用量减少，至治疗后第12周，平均每日胰岛素用量由治疗前的（27.94±1.86）U降至（15.02±2.90）U。与模型组比较，治疗组在治疗后12周三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、HOMA-IR减低（P < 0.05），C肽曲线下面积、HOMA-β升高（P < 0.05）。 结论 UCMSCs经动脉介入治疗2型糖尿病犬，可最大限度地保证干细胞植入胰腺的数量，有效改善糖脂代谢紊乱，减少胰岛素用量，恢复胰岛β细胞功能，减轻胰岛素抵抗。

[关键词] 脐带间充质干细胞；动脉介入；2型糖尿病；胰岛功能；胰岛素抵抗

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells （UCMSCs） transplanted into a dog model of type 2 diabetes mellitus （T2DM） via the arterial intervention. Methods 24 Beagle dogs were randomly divided into UCMSCs treatment group （treatment group， n = 11）， diabetic model control group （model group， n = 8） and normal control group （normal group， n = 5）. Dogs in treatment and model control group were fed on high fat diet and intravenously injected with alloxan to establish T2DM models. Treatment group accepted insulin therapy and UCMSCs transplantation via arterial intervention. Model group only received insulin therapy， and normal group did not receive any treatment. Distribution of UCMSCs traced by CM-Dil was observed under fluorescence microscope. In addition， the three groups were compared with body mass， blood fat， fasting plasma glucose， insulin dosage， Area under the curve of C-peptide， insulin secretion index （HOMA-β）， insulin resistance index （HOMA-IR） before and after therapy. Results The cells traced by CM-Dil mainly distributed in the pancreas and kidney. At 4 weeks after transplantation， fasting plasma glucose and insulin dosage were decreased gradually in treatment group ， up to 12 weeks average daily insulin dose was declined from （27.94±1.86） U to （15.02±2.90） U. Compared with the model group， at 12 weeks triglyceride， low density lipoprotein cholesterol， HOMA-IR decreased （P < 0.05）， under the curve of C-peptide， HOMA-β increased in treatment group （P < 0.05）. Conclusion The method of translation of UCMSCs by artery intervention not only maximum guarantee the stem cells quantity into the pancreas ， but also has great effects on reversing glucose and lipid metabolism disorder， recovering islet β cell function， decreasing insulin dosage， and relieving insulin resistance.endprint

[Key words] Umbilical cord mesenchymal stem cells； Arterial intervention； Type 2 diabetes mellitus； Islet function； Insulin resistance

2型糖尿病（T2DM）的病理生理基础是胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗，通过干细胞治疗实现胰岛再生，从根本上挽救和恢复胰岛功能，减轻胰岛素抵抗，成为探索治疗T2DM新方法的焦点。近年来，人脐带间充质干细胞（UCMSCs）成为治疗糖尿病的重要细胞来源，其应用于糖尿病治疗尚处于探索阶段，Beagle犬作为标准实验动物，具有遗传性状稳定，实验结果重复性好、适应性强等优点，本研究首次将UCMSCs经动脉介入的方式植入2型糖尿病Beagle犬模型体内，观察干细胞在体内各器官的分布，探讨UCMSCs治疗对糖代谢、脂代谢、胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的作用，为UCMSCs治疗T2DM的临床应用提供实验理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 18～20个月健康成年雄性Beagle犬24只，体重（15.0±0.9）kg，由北京芳元缘养殖场提供，动物合格证号：SCXK（京）2009-0014。

1.1.2 人脐带间充质干细胞 由北京大学航天临床医学院中心实验室制备并提供。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将实验犬随机分为UCMSCs治疗组（治疗组，n = 11），糖尿病模型对照组（模型组，n = 8）和正常对照组（正常组，n = 5）。

1.2.2 2型糖尿病 beagle犬模型的建立 采用SPF级饲养，治疗组和模型组高脂饲料喂养4周（20%蛋白质、27%碳水化合物、53%脂肪），然后犬禁食12 h，自由饮水，取新鲜配制的四氧嘧啶溶液（200 g/L）以50 mg/kg經犬下肢浅静脉注射，48 h后监测随机血糖≥11.1 mmol/L至少2次表明造模成功。正常组仅给予标准饲料喂养4周（27%蛋白质、38%碳水化合物、35%脂肪）。

1.2.3 人脐带间充质干细胞的制备和流式鉴定[1] 在GMP标准实验室，采用UltraCultureTM培养基用直接贴壁法进行UCMSCs的扩增培养。取培养的第3代细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，PBS液洗涤2次后重悬细胞，细胞数量调整为1×109/L。取出上述细胞悬液100 μL加入检测管中，分别加入流式单抗CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-APC、CD73-PE、CD34-PE及同型对照抗体IgG1-FITC、IgG1-PE，常温避光静置30 min，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测其表型。

1.2.4 CM-Dil标记人脐带间充质干细胞 将CM-Dil溶于二甲基亚砜（DMSO）中配制成1 g/L的保存液，再稀释成质量浓度为1 mg/L工作液。取细胞悬液（1×109/L）每毫升加5 μL CM-Dil工作液，37℃孵育5 min后，4℃冰箱放置15 min，PBS洗涤2次，生理盐水重悬细胞，调整细胞浓度为1×1010/L。

1.2.5 实验犬的治疗方法 治疗组和模型组实验犬每日给予胰岛素皮下注射治疗，定时监测血糖，根据血糖变化调整并记录胰岛素用量。血糖控制目标值：空腹血糖≤7.0 mmol/L，餐后2小时血糖≤10.0 mmol/L。胰岛素治疗2周后治疗组犬进行UCMSCs的动脉介入植入，从犬的右侧股动脉穿刺，将动脉导管插入供应胰腺的动脉分支，数字剪影血管造影证实后，经导管注入CM-Dil标记的细胞悬液10 mL。模型组及对照组仅在同等条件下注入10 mL生理盐水。

1.2.6 观察指标 UCMSCs植入前24 h及植入后12周，各组犬分别称重，并抽取空腹静脉血检测血糖、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。并以50%葡萄糖1.75 g/kg灌胃，分别于0、0.5、1、2、3 h抽取静脉血，采用罗氏Cobas e411电化学发光仪进行C肽检测，计算C肽曲线下面积、HOMA-β、HOMA-IR。计算方法：C肽曲线下面积=0.25C0 min+0.5C30 min+0.75C60 min+C120 min+0.5C180 min；HOMA-β=270×FCP/0.333/（FPG-3.5）；HOMA-IR=1.5+FPG×FCP/（2.8×0.333）（FPG：空腹血糖；FCP：空腹C肽）。

1.2.7 CM-Dil荧光示踪观察干细胞分布 UCMSCs植入后4周，治疗组处死3只实验犬，迅速取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织，进行连续冰冻切片，用含DAPI的抗淬灭剂封固，标染各组织细胞核。3～5 min后荧光显微镜下观察CM-Dil标记细胞在各器官中的分布。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCMSCs的鉴定结果

流式细胞仪分析结果显示，干细胞表面CD44（99.86%）、CD73（99.80%）、CD105（99.8%）呈高表达，CD34（0.20%）、CD45（0.79%）呈低表达，符合UCMSCs表面标志表达。

2.2 CM-Dil标记细胞在各器官的分布情况

荧光显微镜下观察可见治疗组CM-Dil标记细胞主要分布在胰腺及肾脏内，在心脏、肝脏、脾脏、肺脏中也可见少量分布。见图1。endprint

2.3 UCMSCs治疗前后体质量和血脂的变化

与正常组相比，治疗前模型组和治疗组体质量增加，TG、TC、LDL-C升高，HDL-C降低，差异有统计学意义（P < 0.05），而模型组和治疗组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。与治疗前相比，治疗后模型组TG减低（P < 0.05），治疗组TG、TC、LDL-C均有减低（P < 0.05）。与模型组相比，治疗组在治疗后TG、LDL-C下降更明显（P < 0.05）。见表1。

2.4 UCMSCs治疗前后空腹血糖及胰岛素用量的变化

模型组和治疗组Beagle犬经胰岛素治疗后血糖均明显下降，治疗组在UCMSCs治疗后第4周出现空腹血糖明显低于目标值，每日胰岛素用量逐渐减少。模型组空腹血糖在偏高水平波动，胰岛素用量变化不明显。至UCMSCs治疗后第12周，治疗组每日胰岛素用量已由治疗前的（27.94±1.86）U降至（15.02±2.90）U，其每日胰岛素用量与模型组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2～3。

2.5 UCMSCs治疗前后胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的变化

与正常组相比，治疗前模型组和治疗组C肽曲线下面积、HOMA-β明显减低，HOMA-IR升高，差异有统计学意义（P < 0.05），而模型组和治疗组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。与治疗前相比，治疗组在治疗后C肽曲线下面积、HOMA-β明显改善，HOMA-IR明显减低（P < 0.05），但三者均未恢复到正常组水平（P < 0.05）。与模型组相比，治疗组在治疗后C肽曲线下面积、HOMA-β明显升高，HOMA-IR减低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

近年来，应用干细胞技术重建功能型胰岛β细胞总量，挽救和恢复胰岛β细胞功能，减轻胰岛素抵抗，有望从根本上解决T2DM的病理生理缺陷和代谢紊乱，防止糖尿病并发症的发生。研究[2-4]发现UCMSCs是存在于脐带华通胶、血管及其周围组织中的多能干细胞，其来源丰富，易于分离纯化，低免疫原性，分化增殖能力强，不存在伦理学问题，目前已成为干细胞治疗糖尿病研究的重要细胞来源。本研究中对所分离纯化的细胞进行流式鉴定结果显示，UCMSCs表面标志（CD44、CD73、CD105）呈高表达，造血干细胞表面标志（CD34、CD45）呈低表达，符合UCMSCs特征，证实应用于本实验研究的是均一的人脐带间充质干细胞。

目前干细胞治疗糖尿病的基础研究大多数选择啮齿类动物模型，将干细胞通过静脉、肾被膜下、胰腺被膜下、肝实质内注射等方式植入糖尿病动物模型体内。研究发现胰腺被膜下植入效果优于其他途径[5-6]，但对大型动物模型的干细胞最佳植入途径研究罕见，王丽梅等[7]将骨髓间充质干细胞经动脉介入植入糖尿病犬体内，较好地保证了植入细胞大量集中定居在胰腺局部。本研究中，首次选择了T2DM Beagl犬模型，其更能接近人体生理状态，将UCMSCs经动脉导管靶向植入供应胰腺的动脉分支内，该方法操作简单、安全、创伤小，CM-Dil标记细胞主要分布在胰腺和肾脏内，有效提高了植入细胞在胰腺局部的浓度，从而促进UCMSCs在胰腺微环境中发挥各种作用，是值得临床推广的干细胞植入方式。在犬糖尿病模型体内，胰腺组织受四氧嘧啶作用后短时间内大量破坏，受损组织高表达SDF-1等多种趋化因子，促进植入干细胞向胰腺进一步归巢。但由于在造模过程中四氧嘧啶对糖尿病犬可能造成一定的肾脏损伤，趋化作用使肾脏也出现了较多干细胞分布，这可能与生理状态下干细胞在2型糖尿病患者体内的分布存在差异。

大量研究[8-11]显示HCMSCs具有强的增殖和分化能力，可在体外诱导分化为胰岛样细胞，这种胰岛样细胞对血糖刺激敏感，能够分泌胰岛素，还能表达多种胰岛细胞基因。经HCMSCs治疗的T2DM大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白明显下降，空腹C肽和β细胞数量增加[12]。间充质干细胞输注还可能通过促进内源性胰岛β细胞增殖[13-15]、调节胰岛微环境[16]、免疫调节[17-18]等作用改善高血糖，恢复胰岛功能。在本研究中接受UCMSCs治疗的糖尿病犬在植入后第4周血糖开始逐渐下降，外源性胰岛素用量也相应逐渐减少。至植入后第12周每日平均胰島素用量减至治疗前的53.76%，C肽曲线下面积、HOMA-β明显改善，再次表明将UCMSCs经动脉介入的方法治疗T2DM可以有效减低血糖，逆转胰岛β细胞功能。

研究发现将骨髓间充质干细胞移植至T2DM大鼠体内，可通过增加组织葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达和增强胰岛素受体底物1（IRS-1）和Akt（蛋白激酶B）磷酸化，促进胰岛受体与胰岛素的结合，减轻了胰岛素抵抗[19-20]。UCMSCs治疗对T2DM胰岛素抵抗作用的研究较少，李丽等[21]通过静脉输注HCMSCs逆转了糖尿病模型大鼠的高血糖，改善体质量，空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数显著下降。本研究中与模型组相比，UCMSCs治疗后12周TG、LDL-C明显下降，HOMA-IR明显降低，进一步提示UCMSCs治疗有效改善了2型糖尿病犬的脂代谢紊乱，同时减轻了胰岛素抵抗，从而促进糖代谢紊乱的恢复。

综上所述，将人脐带间充质干细胞经动脉介入移植入糖尿病犬胰腺内，不仅最大限度地保证干细胞植入胰腺局部的数量，还可以有效改善糖尿病犬的高血糖、高血脂状态，减少胰岛素用量，恢复胰岛β细胞功能，减轻胰岛素抵抗，具有很好的临床应用价值。

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（收稿日期：2017-02-07 本文编辑：苏 畅）endprint