不同试验周期下Cu对玉米种子发芽和根伸长的影响

何颖妍 邓桂荣 曾国驱

摘要：为探究植物种子是否会因为受试物暴露时间不同而得到不同的发芽抑制率、根长下降率及EC50，进而影响受试物生态毒理学危害性级别的判定，选用玉米为试验种子，CuSO4·5H2O为受试物，设置了6个受试物浓度组，开展了周期为2～7 d的试验。结果表明：在中低暴露浓度下，不同周期对玉米种子发芽率影响较大，发芽抑制率的EC50最值相差高达352.9 mg/L，也使根长出现显著性差异，但根长下降率及其EC50无明显差异。得出了试验周期不同，不影響CuSO4·5H2O生态毒理学危害性分级结果的结论。

关键词：试验周期；发芽抑制率；根长下降率；半最大效应浓度

中图分类号：

文献标识码：A文章编号：16749944（2017）16000404

1引言

由于当代环境污染问题日益严重，国家环保部门对化学品管理越来越严格。尤其是新化学物质方面，在其登记注册投入生产前需要进行环境风险评估，根据其产量进行分类管理，减少化学物质进入环境后的潜在风险。

高等植物是生态系统基本的组成部分。目前有2种陆生植物生态毒理试验用于化学品测试[1]，一种是种子发芽和根伸长的毒性试验，另一种是陆生植物生长活力试验。前者常用于测定受试物对陆生植物种子发芽和根部伸长的抑制作用，评价受试物对植物胚胎发育的影响。种子萌发是植物生长周期中最为关键的阶段，也是对周围环境最为敏感的时期[2，3]。目前，种子发芽和根伸长毒性试验是我国新化学物质陆生植物生态毒理测试中对受试物进行环境风险评估的重要技术之一[4]，明确规定进行三级或以上申报时，应提交该测试数据，除非受试物满足如土壤吸附率过低等豁免条件[5]。

随着中国加入了世界贸易组织（World Trade Organization， WTO），在与经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development， OECD）成员国进行化学品国际贸易过程中所提交的测试数据必须为其准则规定的方法。准则对种子发芽和根伸长毒性试验进行了较为详细的介绍，但对植物种子的试验周期却没有明确规定，仅说明对照组种子发芽率在65%以上且根伸长长度达至少20 mm时，即可结束试验[6]。仅凭试验人员的经验来决定试验周期，主观性强，较为随意。植物种子是否会因为受试物暴露时间不同而出现不同的EC50，差异有多大，是否会影响受试物生态毒理学危害性分级，目前尚未见相关报道。因此，研究不同试验周期下植物种子对受试物的响应情况，具有重要的实用价值。

试验以石英砂为基质，选用玉米为受试植物种子，CuSO4·5H2O为受试物。探究Cu在不同试验周期中对受试种子发芽和根伸长毒性的影响，为测试机构在工作实践中优化试验条件提供理论依据。

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1受试物

CuSO4·5H2O（≥99%），分析纯，购于广州化学试剂厂。

2.1.2试验种子及处理

选用玉米（Zea mays）为受试种子。玉米为《化学品测试方法》推荐的受试植物之一，购于广东省农科院蔬菜研究所。

试验开始时将玉米种子放在去离子水中漂洗和浸泡1 h，未进行消毒处理。试验时选取大小、饱满度一致的种子，弃掉破损的种子。

2.1.3试验基质

石英砂，粒径为40～100 μm。

2.1.4仪器

人工气候箱、三按键电子数显卡尺、手提式pH测试仪、DSR系列温湿度记录仪。

2.2试验条件

25±1 ℃，黑暗。

2.3试验方法

2.3.1试验操作

设置1个空白对照组和6个受试物处理组，每个平行10粒种子。用CuSO4·5H2O作为基质中Cu的来源，浓度以Cu计。受试物浓度系列分别为0、10.0、50.0、100、500、800、1000 mg/L。

试验前测定石英砂的pH值[7]及其饱和含水量[8]。按石英砂饱和含水量的60%将受试物溶液添加至石英砂中（空白对照组以去离子水替代），充分混匀后，分装至培养皿中，再将玉米种子置于石英砂表面，轻压入内，覆盖少量石英砂，并保持种子胚根末端和生长方向成一直线。盖好培养皿，并用保鲜膜密封。将培养皿放入人工气候箱中，呈极小的角度便于根的直线生长。

分别在第2、3、4、5、6、7 d从每个试验组中随机取出2个平行，计算发芽率，并使用电子数显卡尺测量各种子根长，根长的测定从位于胚轴和根的转换点到根尖末端。当种子初生根的长度达5 mm时，视为发芽。

2.3.2数据统计

应用Microsoft Office Excel 2003统计种子发芽率、平均根长、发芽抑制率以及根长下降率。分别使用SPSS Statistics 17.0和Trimmed Spearman-Karber Method进行根长单因素方差分析以及计算根伸长下降率和发芽抑制率EC50及其95%置信限。统计显著水平设为P=0.05。

3结果与分析

3.1不同试验周期对玉米种子发芽率的影响

从表1可知，试验进行至第3d时，空白对照组的发芽率已达到试验结束质量控制的最低要求，且在第5d得到最大值，发芽率开始时随着试验周期增长而增长，最后稳定下来。当Cu浓度较低如10 mg/L和50 mg/L时，在各试验周期中玉米种子发芽率与空白对照组持平甚至更高，总体上未呈现出明显的抑制作用，甚至有点促进作用。而当Cu浓度提高至500 mg/L及以上时，玉米种子的发芽率均保持显著抑制，与试验周期的长短不存在明显关联。试验周期的长短对玉米种子发芽率的影响不明显，总体均符合“低促高抑”的现象。endprint

3.2不同试验周期对玉米种子根长的影响

从表2可知，空白对照组和低浓度组（10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L）的平均根长几乎随着试验周期的延长而增长，而浓度为500 mg/L、800 mg/L和1000 mg/L的平均根长相对稳定。这与表4的根长单因素方差分析结果是吻合的，这表明增长暴露时间，会使低浓度受试物组的平均根长出现显著性差异，而高浓度受试物组则不显著。

由表3可以看出，根长下降率与Cu浓度都具有较好的线性关系，Cu浓度越大对种子根部生长抑制作用就越强。在低浓度组（10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L）中不同试验周期的根长下降率差异较大。如当Cu浓度为50 mg/L时，试验第3d的根长下降率为33.6%，第4d仅为4.6%，两者差别为29%，当Cu浓度为100 mg/L时，试验第4d的根长下降率为47.8%，第7d为79.0%，两者差别为31.2%。当Cu浓度为500 mg/L及以上时，同一浓度下不同试验周期中的根长下降率差异不大，而且根长下降率有随着试验周期的增长而平稳增长的趋势。在不同试验周期中，施加同样的Cu浓度对种子根长生长并未出现明显的规律影响，但是可以看出试验周期对低浓度组的影响大于高浓度组。

3.3不同试验周期对玉米种子发芽抑制率和根长下降率EC50的影响

由表5可知，在Cu系列浓度作用下，不同试验周期得到的发芽抑制率和根长下降率的EC50均不一致。玉米种子发芽抑制率EC50在249.4～602.3 mg/L之间，最高值出现在第4d，最低值出现在第5 d，最值相差352.9 mg/L。玉米种子根长下降率EC50在55.1～133.6 mg/L之间，最高值出现在第4d，最低值出现在第7d，最值相差78.5 mg/L。從发芽抑制率和根长下降率的EC50都可以看到3d、4d试验周期的EC50均明显高于5 d、6 d、7 d的，而且后三者的EC50较为接近。由此可以看出，长试验周期可以得到更加稳定、可靠的EC50。

4讨论

在不同试验周期中，Cu对玉米种子发芽存在“低促高抑”现象，这与高柱[9]的研究结果一致。种子的发芽类型可以归为三类，即冒险型、机会型和稳定型[10]。一般来说，种子发芽即便是在合适的环境条件下还是需要一段适应和诱导时间。这可能是由于种子在发芽过程养分的供应主要是来自于胚内，直接从胚乳中吸取养分。种子一般先通过吸水膨胀，然后激活体内酶原，进而合成新酶，开始进入发芽状态[11，12]。虽然导则规定空白对照组种子发芽率大于65%，根伸长长度达到20 mm，即可结束试验，但是在短时间试验周期中，根据种子发芽的规律，种子没有足够充分时间发芽，部分种子还处于适应期，虽能满足试验结束的要求，但不利于探究受试物对玉米种子发芽的影响，未能充分地体现出受试物的作用。而在长时间试验周期中的种子能有充足时间发芽，能更好地体现出受试物对种子发芽的影响。在该研究中，玉米种子发芽抑制率的EC50表明：5 d试验周期是最合适的。因此在探究有毒性的受试物对植物种子发芽影响的研究当中，适当地增长试验周期可能会有利于更好地体现出受试物的影响。

随着试验周期的增加，低浓度组的平均根长有显著性差异，高浓度组则不显著，同一浓度之间的根长下降率也没有显著差异。这可能是与玉米种子根系直接接触受试物有关，根系生长受到直接影响。当受试物浓度较低时，其毒性不足以抑制根生长，所以根部随着试验周期的延长而明显增长，但提高受试物浓度后，在较强的毒性作用下，试验周期延长对根部生长的贡献甚微。Liu等[13]指出，与植物种子发芽有关的各种指标的敏感顺序为：根长>根生物量>芽长>总生物量>地上部生物量>发芽率。有研究指出，发芽率是最不敏感的指标[14]。通过比较玉米种子发芽抑制率和根长下降率的EC50，可以发现根长下降率的EC50远小于发芽抑制率EC50，表明根生长对受试物响应比发芽率更为敏感，此结果与Liu等的结论相符合，也与Kjaer[15]研究结果相似。在该研究中，玉米种子根长下降率的EC50表明5d试验周期是最合适的，试验敏感性最高。由此说明，在满足试验条件下，有毒性的受试物暴露试验周期的长短是不会影响种子的根长下降率，均可体现受试物毒性。

在新化学物质申报过程中，根据种子发芽和根伸长试验的毒理学数据可以将新化学物质环境危害性分为3类别，即急性毒性极高、急性毒性高和急性毒性中等，分别对应的LC50为≤1 mg/L、1～10 mg/L和10～100 mg/L[16]。在该研究中玉米种子发芽抑制率的EC50均处于低级危害水平，说明不同试验周期不影响CuSO4·5H2O的生态毒性学危害性分级结果。玉米种子根长下降率的EC50除4d试验周期处于低级危害水平外，其他试验周期的均处于中级危害水平，不同试验周期对CuSO4·5H2O生态毒性级别没有显着影响。从玉米种子发芽和根伸长整个毒性试验来看，不同试验周期对受试物的环境危害性级别的影响是不明显的。

5结语

一个合适的试验周期可以保证试验敏感性。在新化学物质登记评审中，“凭安全性举证”和“疑者从重”是新化学物质危害评估的重要原则[17]，申报人需要提供必要的测试数据来证明所申报物质对生态环境的安全性和可控性，而试验周期适当增长有利于提高化学物质安全性的可信程度以及增加其可控性，减少进入环境的潜在风险，让环境风险评估真正有效地发挥作用。

参考文献：

[1]

环境保护部化学品登记中心《化学品测试方法》编委会.化学品测试方法 生物系统效应卷， 299 种子发芽和根伸长的毒性试验（Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test）[M]. 2版. 北京： 中国环境出版社， 2013：459～463.

[2]Amira Sfaxi-Bousbih， Abdelilah Chaoui， Ezzedine El Ferjani. Cadmium impairs mineral and carbohydrate mobilization during the germination of bean seeds [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2010，73（8）：1123～1129.endprint

[3]Ting Ting Liu， Peng Wu， Li Hong Wang. Response of soybean seed germination to cadmium and acid rain [J]. Biol Trace Elem Res， 2011， 144（13）：1186～1196.

[4]OPPTS. Ecological Effects Test Guidelines， OPPTS 850.4200 Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test [S]. US EPA， 1996.

[5]中华人民共和国环境保护部. 新化学物质申报登记指南[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[6]OPPTS. Ecological Effects Test Guidelines， OPPTS 850.4200 Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test [S]. US EPA， 1996.

[7]ISO 10390：2005. Soil Quality -Determination of pH [S]. [s.l.]、[s.n.].2005.

[8] 浙江农业大学种子教研组.种子检验简明教程[M]. 北京：农业出版社. 1980.

[9]高柱， 王小玲， 刘腾云， 等. 重金属Cu污染对苏丹草种子发芽及幼苗生长的影响[J]. 中国农学通报. 2013， 29（25）：199～204.

[10]张景光， 王新平， 李新荣， 等. 荒漠植物生活史对策研究进展与展望[J]. 中国沙漠. 2005， 25（3）：306～313.

[11]金彩霞， 郝苗青， 王庆纬， 等. 利巴韦林对4种作物种子发芽的影响[J]. 生态毒理学报. 2013， 8（1）：37～41.

[12]宋玉芳， 许华夏， 任丽萍， 等. 土壤重金属对白菜种子发芽与根伸长抑制的生态毒性效应[J]. 环境科学. 2002， 23（1）：103～107.

[13]Liu X L， Zhang S Z， Shan X Q， et al. Toxicity of arsenate and arsenite on germination seedling growth and amylolytic activity of wheat[J]. Chemosphere， 2005， 61（13）：293～301

[14]Kapustka L， Lipton J， Galbraith H， et al. Metal and arsenic impacts to soils， vegetation communities and wild-life habitat in southwest Montana up lands contaminated by smelter emissions.Ⅱ. Laboratory phytotoxicity studies[J]. Environmental Txicology and Chemistry， 1995（14）：1905～1912

[15]Kjaer C， Pedersen N， Elmegaard N. Effects of soil copper on black bindweed （Fallopia convovulus） in the laboratory and in the field. Arch. Environ. Contamn[J]. Toxicol.， 1998， 35（4）：14～19.

[16]國家环境保护总局. 新化学物质危害性鉴别导则：HJ/T154-2004[S]. 北京：中国标准出版社，2004.

[17]聂晶磊， 周红， 刁树林， 等. 新化学物质环境管理与生态毒理学[J]. 毒理学杂志，2005， 19（1）：12～14.endprint