不同等级山药种栽与其内源激素(IAA、GA3)含量及蔗糖酶活性之间相关性研究△

张岩荣，董诚明，薛南南，任龙飞,刘丹

(河南中医药大学，河南 郑州 450008)

·中药农业·

不同等级山药种栽与其内源激素(IAA、GA3)含量及蔗糖酶活性之间相关性研究△

张岩荣，董诚明*，薛南南，任龙飞,刘丹

(河南中医药大学，河南 郑州 450008)

目的：由于山药在种植过程中缺乏种栽标准，造成山药的产量与质量稳定性差，本文主要通过研究不同等级山药种栽中内源激素(IAA、GA)和蔗糖酶含量的差异，以及内源激素(IAA、GA)和蔗糖酶含量与各级种苗相关性，为建立山药种栽标准提供依据。方法：根据药用山药种栽的长度、直径、重量、芽数、净度、饱满度等形态学指标，运用SPSS Statistics 17.0分析软件进行K-均值聚类分析，对山药种栽进行分级，并对不同等级山药种栽内源激素(IAA、GA3)含量、蔗糖酶活性之间相关性进行分析。结果：制定了山药种栽的等级划分标准：一级：长度：≥26.8 cm、直径：≥2.40 cm、重量：≥51.0 g、芽数：≥3.0、净度：100%、饱满度：100%；二级：长度：≥22.5 cm、直径：≥2.10 cm、重量：≥36.0g、芽数：≥2.0、净度：100%、饱满度：100%；三级：长度：≥18.3 cm、直径：≥1.80 cm、重量：≥20.0 g、芽数：≥1、净度：≥99.0%、饱满度：≥99.0%；山药种栽中内源激素(IAA、GA3)含量、蔗糖酶活性与各级种苗之间存在相关性。结论：不同等级的山药种栽中生理指标的差异，为药用山药的规范化种植提供了理论和实践依据。

药用山药；种栽；等级；内源激素；酶活性

山药为薯蓣科多年生缠绕草本植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎，始载于神农本草经，被列为上品，其性平，味甘，归脾、胃、肾经，功能补脾养胃、生津益胃、补肾涩精[1]。为河南省著名道地药材——四大怀药之一，自夏、商时期起就有栽培山药的历史，到了明清以来逐渐形成道地药材。河南焦作地区的温县、博爱、武陟、沁阳等地是我国正品山药的道地和主要产区，这里出产的山药特称“怀山药”，品质优良，久负盛名。

农户在山药种植方面大多依靠传统的经验，加上国家尚未有相关的山药质量评价方法，结果造成在山药生产过程中没有标准可依。目前，山药种栽大致可以分为三种：山药芦头、山药块茎、零余子。山药芦头又称“山药栽子”，是山药块茎的较细的先端，有一个隐芽和茎的斑痕，通常被用来做种栽；山药块茎也称山药段子，将山药块茎按8～10 cm分切成段；山药零余子是用上年选育贮藏的山药零余子繁育后做成的种栽。这就造成了山药种栽混乱、质量好坏参差不齐，结果造成农户生产的山药有效成分含量不达标，产量也受到很大的影响，严重降低了山药种植户的经济效益。为此，结合实际山药种植过程中存在的问题，我们开展了对药用山药种栽标准的研究[2]。

植物内源激素调控着植物的生长、发育与分化，其中吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量、蔗糖酶活性与山药的生长发育有着密切的联系，朱海旺等[3]研究了长山药块茎在休眠期的内源激素的含量变化，结果发现在山药的不同休眠期，内源激素有较大的变化趋势，为此，本实验测定了不同等级种栽中内源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶含量的变化，来研究不同等级的药用山药中内源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶活性是否存在较大差异，来进一步验证山药种栽分级划分的合理性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

河南焦作温县收集的药用山药种栽芦头，经河南中医药大学董诚明教授鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 山药种栽的形态学测定 长度 用量程为50 cm的直尺测量取样药用山药种栽的长度，精确到0.1 cm。

重量 用电子天平，称量取样山药种栽的重量，精确到0.1 g。

围径 用数显游标卡尺准确量出每根山药种栽最粗处的围径，精确到0.001 cm。

芽数 记录各山药种栽顶端的芽数。

净度 除去山药种栽中的霉变的、损伤的、杂质、泥土、砂石、土块等重量后的比例。

饱满度 外在饱满、无损伤的、健壮的山药种栽称为饱满的种栽，其占全部供试样品的比例。

饱满度=饱满种栽数/供试样品数

1.2.2 山药种栽的分级 利用SPSS Statistics 17.0分析软件，对药用山药种栽的形态学指标进行相关性分析，确定优先指标及顺序，然后进行K-中心聚类分析[4]，将山药种栽分为三级。

1.2.3 山药种栽中吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量的测定 称取顶端山药种栽1.0 g(精密到0.000 1 g)，用剪刀剪碎，置于液氮中速冻，然后再用2 mL 80%甲醇溶液(内含1 mmol·L-12，6-二叔丁基对甲酚；BHT)研磨成浆，4 ℃冰箱中提取4 h，4000 r·min-1离心15 min，沉淀用80%甲醇溶液重复提取3次，每次1 h，合并上清液，上清液用氮气吹干仪吹干，然后用样品稀释液(0.01 mmol·L-1pH 7.2 PBS磷酸盐缓冲液)溶解定容至5 mL容量瓶中[5-6]，最后用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)测定。

具体操作步骤如下：1)在板孔上与待测样品与相对应的位置上作好标记；2)手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1 min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板3次即可；3)在板孔上设置标准品孔和样本品孔并各加不同浓度的标准品溶液50 μL；4)样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，空白孔不加；5)除空白孔外，标准品孔和样本品孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min；6)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复5次即可；7)每孔加入终止液50 μL，15 min内，用酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。

1.2.4 蔗糖酶活性的测定

1.2.4.1 酶的提取 取不同等级的药用山药1.0 g，精密称定，用剪刀迅速剪碎，然后用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100 mL，在冰箱中浸提3 h，4000 r·min-1离心15 min，上清液即为酶的粗提液。

1.2.4.2 酶活性的测定 用移液管移取2 mL酶的粗提液，置于20 mL带刻度的试管中，再加入5 mL pH 6.0的磷酸盐缓冲液及1 mL 10%蔗糖溶液，在37 ℃水浴锅中保温0.5 h，取出后立即按3，5-二硝基水杨酸法[7]测定还原糖的含量。以煮沸酶液10 min钝化酶的试管作对照。

1.2.4.3 还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

1)制作标准曲线：取6支20 mL带刻度的试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

管号123456葡萄糖原液量/mL00.40.81.21.62.0加蒸馏水量/mL2.01.61.20.80.40葡萄糖浓度/μg·mL-10100.0200.0300.0400.0500.0

在上述6支试管中分别加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5 min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20 mL，混匀，以1号管为空白，测540 nm波长下的A值。以A值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2)酶反应液中还原糖含量的测定：吸取2 mL酶反应液，加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温后，用蒸馏水定容至20 mL，测定540 nm处的A值。查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

3)结果计算

转化酶的活性用还原糖量表示，计算公式如下：

其中，U表示转化酶的活性，mg·g-1·fw-1·h-1；

N表示酶反应液中还原糖的浓度，μg·mL-1；

N′表示钝化酶反应液中还原糖的浓度，μg·mL-1；

V表示酶反应液的总体积；

T表示反应时间；

W表示材料鲜重。

2 结果与分析

2.1 药用山药种栽的形态学指标测定

材料为从河南焦作温县不同乡镇收集的药用山药种栽，测量6个形态学指标(长度、重量、直径、芽数、净度、饱满度)。

表1 药用山药种栽的形态学指标测定

2.2 山药种栽的分级

用SPSS Statistics 17.0分析软件，对药用山药种栽形态学指标进行相关性分析，然后再进行K-中心聚类分析，将药用山药种栽分为三级，得到药用山药种栽的质量分级标准。

表2 药用山药种栽质量分级指标的相关性分析

注：**表示在0.01水平上极显著相关；*表示在0.05水平上显著相关。

在对药用山药种栽进行分级之前，我们测定了6个形态学指标(长度、直径、重量、芽数、净度、饱满度)，结合实际生产经验将芽数作为主要分级指标，由上述的SPSS Statistics 17.0相关性分析可以确定分级指标的优先顺序，因为芽数与长度、直径、重量显著相关，而与净度、饱满度无相关性。因此，确定芽数、长度、直径、重量作为主要分级依据，净度和饱满度作为参考依据；质量分级指标如表3所示。

由表3可知，确定了山药种栽的等级划分标准，由于芽数与长度、直径、重量显著相关，所以如果若芽数、长度、直径、重量这4个指标有一项不达标则降一级。

表3 药用山药种栽质量分级标准

2.3 等级与种栽内源激素(IAA、GA3)含量的相关性研究

2.3.1吲哚乙酸(IAA)含量测定结果

2.3.1.1 IAA标准曲线结果 由实验数据得IAA标准曲线方程为Y=0.029 6X-0.015 2(r=0.999 7)，其中X为IAA标准品的浓度；Y为IAA标准品溶液在450 nm波长处的A值。

2.3.1.2 不同等级的药用山药种栽中IAA含量比较结果 用酶联免疫吸附法(ELISA)，结果如表4所示。

表4 不同等级药用山药种栽IAA含量

图1 不同等级药用山药种栽中IAA含量

由表4、图1可以看出，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定不同等级的药用山药种栽中IAA含量，结果表明不同等级之间IAA含量存在差异，一级最高为0.445 μg·g-1，二级次之为0.430 μg·g-1，三级最低为0.211 μg·g-1，由此可以说明种栽等级与IAA含量之间存在相关性关系。

2.3.2 赤霉素(GA3)含量测定结果

2.3.2.1 GA3标准曲线结果 由实验数据得GA3标准曲线方程为Y=0.0141X+0.0319(r=0.996 4)；，其中X为GA3标准品的浓度；Y为GA3标准品溶液在450 nm波长处的A值。

2.3.2.2 不同等级药用山药种栽GA3含量比较结果 用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，结果如表5。

表5 不同等级药用山药种栽GA3含量比较

图2 不同等级药用山药种栽GA3含量

由表5、图2可以看出，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定不同等级的药用山药种栽中GA3含量，结果表明不同等级之间GA3含量存在差异，一级最多为0.196 mg·g-1，二级次之为0.182 mg·g-1，三级最少为0.153 mg·g-1，由此可以说明山药种栽与GA3含量存在相关性关系。

2.4 等级与种栽蔗糖酶酶活性的相关性研究

2.4.1 蔗糖酶标准曲线结果 由实验数据得到蔗糖酶标准曲线方程为Y=0.0021X-0.998 9(r=0.997 8)；其中X为葡萄糖浓度，Y为葡萄糖溶液在540 nm波长处的A值。

2.4.2 不同等级药用山药种栽蔗糖酶(AI)活性比较结果 不同等级的药用山药种栽蔗糖酶含量测定结果如表6所示。

由表6、图3可以看出，不同等级种栽中蔗糖酶活性存在差异，一级最大为0.320 5 mg·g-1fw-1h-1，二级次之为0.096 6 mg·g-1fw-1h-1，三级最小为0.086 4 mg·g-1fw-1h-1。蔗糖酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，是植物细胞代谢及生长强度的指标[4]。表6、图3得出的结果表明种栽等级可能与蔗糖酶活性之间存在相关性关系，即等级高的种栽，蔗糖酶活性大，生长代谢也可能也就越旺盛。

表6 不同等级药用山药种栽蔗糖酶活性结果

图3 不同等级药用山药种栽中蔗糖酶活性结果

3 讨论

品质优良的中药材种子种苗是保证中药材质量的首要因素，也是中药材规范化种植所面临的最严重的问题之一，我国中药材种子种苗尚未形成独立产业，处于一种自产自销的生产状态。150种栽培药材除人参、甘草、黄芪、三七外均没有相关的种子种苗国家质量标准[7]。本文结合中药材生产的实际情况及中药材种苗质量标准研究的实践[8-11]，研究了河南省焦作温县地区的药用山药种栽其长度、直径、重量、芽数、净度、饱满度与等级之间的相关性，探讨了与药用山药生长发育过程相关的内源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶活性与等级的相关性研究，制定了药用山药种栽分级标准，进而指导药用山药的规范化种植，提高山药实际生产的产量及质量。

4 结论

从实验结果可以看到，药用山药种栽形态学指标、IAA、GA3、蔗糖酶活性等方面与等级都存在着非常显著的相关性关系，这就要求我们在分级的操作过程中不仅要注重种栽形态学指标，更要从生理学指标对其分级结果进行验证。基于本实验，我们初步制定了药用山药种栽的分级标准：一级：长度：≥26.8 cm、直径：≥2.40 cm、重量：≥51.0 g、芽数：≥3.0、净度：100%、饱满度：100%；二级：长度：≥22.5 cm、直径：≥2.10 cm、重量：≥36.0 g、芽数：≥2.0、净度：100%、饱满度：100%；三级：长度：≥18.3 cm、直径：≥1.80 cm、重量：≥20.0g、芽数：≥1.0、净度：≥99.0%、饱满度：≥99.0%。等级与山药的生长发育状况成相关性，此外不同等级的药用山药种栽中IAA、GA3含量和蔗糖酶活性之间也存在相关性关系，即一级最高，二级次之，三级最低，结果表明，对药用山药种栽进行等级划分十分有必要，不仅能够规范农户对山药种栽的优选，更进一步对山药种栽标准的建立具有重要意义。

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CultivationofDifferentGradeYamandCorrelationbetweenEndogenousHormone(IAA，GA3)ContentandInvertaseActivity

ZHANGYanrong，DONGChengming，XUENannan，RENLongfei，LIUDan

(HenanUniversityofChinesemedicine，Zhengzhou450008，China)

Objective：Due to the lack of yam cultivation standards，the problems of quality and stability have resulted in yam production.In this paper，the different grade of yam cultivation endogenous hormone (IAA，GA) and invertase content differences，and the content of endogenous hormones (IAA，GA) and sucrase and seedlings correlation at all levels were studied in order to provide the basis for establish of yam plant standards.Methods：According to morphological indexes such as length，diameter，weight，number of buds，clarity，fullness and other indicators，the yam cultivation was classified by using SPSS Statistics 17.0 software K-means clustering analysis. The correlation between yams grade and the content of endogenous phytohomones (IAA，GA3) invertase activity was explored.Results：We developed a standard classification of medicinal yam seedlings。Class 1：Length：≥26.8 cm，diameter：≥2.40 cm，Weight：≥51.0 g，buds：≥3，Clarity：100% fullness：100%；Class 2：length：≥22.5 cm，diameter：≥2.10 cm，weight：≥36.0 g，buds：≥2.0，clarity：100.0% fullness：100.0%；Class 3：length：≥18.3 cm，diameter：≥1.75 cm，weight：≥20.0 g，buds：≥1 clarity：≥99.0%，plumpness：≥99.0%.There existed a correlation between endogenous hormones (IAA，GA3) content and all levels of seedlings.Conclusion：The medicinal yam of different grades has significant difference between physiological indexes，which provided a basis both in theory and in practice.

Medicinal yam；seedlings；grade；endogenous hormones；sucrase

2016-08-12)

国家中药标准化项目(ZYBZH-Y-HEN-18);中央财政支持地方科技发展专项

*

董诚明，教授，研究方向：中药资源学；Tel：(0371)65962581，E-mail：dcm371@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.017