UPLC-MS/MS法同时测定比格犬血浆中表儿茶素与4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素△

戴玮，付淑军，常新全，王鹏，郝彧，左臣强，石小娜,何新

[1.中国中药公司，北京 100195；2.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；3.天津市创新药物早期成药性评价企业重点实验室(筹)，天津 300457；4.瀚盟测试科技(天津)有限公司，天津 300457；5.天津国际生物医药联合研究院，天津 300457]

·基础研究·

UPLC-MS/MS法同时测定比格犬血浆中表儿茶素与4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素△

戴玮1，付淑军2，3，4，常新全1，王鹏3，4，5，郝彧2，左臣强5，石小娜4,何新2

[1.中国中药公司，北京 100195；2.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；3.天津市创新药物早期成药性评价企业重点实验室(筹)，天津 300457；4.瀚盟测试科技(天津)有限公司，天津 300457；5.天津国际生物医药联合研究院，天津 300457]

目的：建立UPLC-MS/MS法同时测定比格犬血浆中表儿茶素(EC)与4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素(Cya-EC)的浓度，研究比格犬口服威麦宁胶囊后体内药代动力学。方法：血浆样品经盐酸巯乙胺衍生化处理后，以乙腈-水(0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱，Waters BEH Shield RP18(100 mm×2.11 mm，1.7 μm)色谱柱分离，采用电喷雾电离源，以多反应监测方式进行正离子检测，定量分析所用的离子反应分别为m/z291.1138.9(EC)、m/z366.1288.9(Cya-EC)和m/z260.2116.3(内标：普萘洛尔)。结果：测定血浆中EC及Cya-EC的线性范围均为10 ～ 2000 ng·mL-1，日内、日间精密度均小于14.82%，准确度均在±4.86%以内；使用DAS3.0药代动力学软件对血药浓度数据进行处理，计算药动学参数，EC及Cya-EC的主要药动学参数t1/2分别为66.3和90.4 h，AUC0-∞分别为2 114.7和12 909.5 ng·h·mL-1。结论：本文建立的UPLC-MS/MS法运行时间短、选择性强、灵敏度高、操作简便、血浆用量少，适用于比格犬口服威麦宁胶囊后体内EC及Cya-EC的药代动力学研究。

表儿茶素；4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素；超高效液相色谱-串联质谱；比格犬血浆；威麦宁胶囊

威麦宁胶囊是由蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)多年生草本植物金荞麦Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara中提取出的抗癌活性物质制成的原国家二类中药新药，具有活血化瘀、清热解毒、祛邪扶正的功效，配合放、化疗治疗肿瘤有增效、减毒作用，单独使用可用于不适宜放、化疗的肺癌患者的治疗，能够改善晚期肺癌患者生活质量及免疫功能[1]等。威麦宁胶囊的有效成分威麦宁为缩合鞣质类化合物，该类化合物以黄烷-3-醇为结构单元通过碳-碳键聚合而成，其分子结构受黄烷-3-醇单元的类型、单元之间的连接方式、聚合单元数量、空间构型等因素的影响，差异较大。由于威麦宁组成结构复杂，目前尚无有效方法对威麦宁胶囊在生物体内的代谢情况进行表征评价。研究表明，威麦宁经巯乙胺硫解后，硫解产物分别为4β-(2-氨基乙硫基)儿茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素、儿茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、4β-(2-氨基乙硫基)儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯，其中主要为4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素，即表儿茶素为威麦宁最主要的结构单元[2]。本研究采用巯乙胺硫解法结合超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)，建立了同时测定比格犬口服威麦宁胶囊后血浆中的4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素和表儿茶素的分析方法，该方法操作简便、快速、选择性强，为威麦宁组分体内药代动力学研究提供方法。

1 材料

1.1 仪器

Waters UPLC-Quattro Premier XE 三重四级杆液质联用仪，含Binary Solvent manager，Sample manager，Quattro Premier XE MS，Masslynx V4.1色谱工作站，ESI和APCI接口离子源；Qilinbeier旋涡混合器；Heraeus multifuge X3R高速冷冻离心机。

1.2 试剂

表儿茶素(Epicatechin，EC，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：YA0402SC13)；4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素(Cya-EC，军事医学科学毒物药物研究所，纯度≥98%)；盐酸普萘洛尔(Propranolol hydrochloride，Pro，购于美国Sigma Aldrich公司，纯度≥99%，批号：16524AH)；威麦宁胶囊(北京华颐药业有限公司，批号：130401)；盐酸巯乙胺(美国Sigma Aldrich公司，纯度≥98%，批号：MKBQ8406V)；甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.3 动物

Beagle比格犬，体重9～10 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。空白比格犬血浆由天津国际生物医药联合研究院新药毒理评价平台提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及质谱条件

色谱柱：Waters BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A-水(含0.1%甲酸，V/V)，B-乙腈(含0.1%甲酸，V/V)梯度洗脱。梯度洗脱程序：0～1.0 min，95%～95% A；1.0～4.8 min，90%～84% A；4.8～6.3 min，84%～60% A；6.3～6.5 min，60%～5% A ；6.5～7.5 min，5%～5% A；7.5～7.51 min，5%～95% A ；7.51～10.0 min，95%～95% A。流速：0.3 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：-3.2 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：800 L·h-1；锥孔气流速：50 L·h-1；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测(MRM)；EC、Cya-EC和Pro的锥孔电压(Cone)分别为：22、15、35 V；碰撞能量(Collision)分别为：16、10、18 V；用于定量分析的离子反应分别为m/z291.1138.9(EC)、m/z366.1288.9(Cya-EC)和m/z260.2116.3(Pro)，见图1。

注：A.EC；B.Cya-EC；C.普萘洛尔。图1 EC、Cya-EC和普萘洛尔[M+H]+的产物离子扫描质谱图

2.2 样品来源

选取健康Beagle比格犬8只(雄性)，体重(9±1.0) kg，实验前1天禁食12 h以上，不禁水，给予威麦宁胶囊8粒(每粒含威麦宁200 mg)。实验前抽取空白血，给药后分别于0、10、20、30 min及1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84 h共16个时间点取前肢静脉血1 mL，置于含肝素的离心管中，冰浴中放置，4 ℃下于0.5 h内3000 r·min-1离心10 min收集上层血浆，-80℃冰冻保存待测。

2.3 血浆样品处理

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 方法的专属性 分别取6只比格犬的空白血浆50 μL，除不加内标外，其余按2.3项下操作，进样5 μL，得空白样品色谱图2A；将一定浓度的EC标准溶液、Cya-EC标准溶液和内标普萘洛尔溶液加入空白血浆中，依同法操作，得相应色谱图2B；将一定浓度的威麦宁提取物溶液和内标普萘洛尔溶液加入空白血浆中，依同法操作，得相应色谱图2C；取比格犬给药后收集的血浆样品，依同法操作，得相应色谱图2D。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰EC、Cya-EC和内标普萘洛尔的测定。

3.1.2 标准曲线和定量下限 取空白血浆50 μL，依次加入EC和Cya-EC的混合标准系列溶液10L，配制成相当于血浆浓度为10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1的血浆样品，按2.3项下操作，取5 μL进样，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。典型的回归方程分别为：EC，Y=0.002 65X-0.006 21，r=0.990；Cya-EC，Y=0.001 79X+0.003 41，r=0.997。测定EC和Cya-EC的线性范围均为10 ～ 2000 ng·mL-1。

取空白血浆50 μL，配制成相当于EC和Cya-EC血浆浓度均为10 ng·mL-1的样品，将其进行6个样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测定浓度，求得该浓度下EC和Cya-EC的日内精密度(RSD)分别为12.0%和7.5%；准确度(RE)分别为-3.8%和-4.6%。该结果表明LC-MS/MS法测定血浆中EC和Cya-EC的定量下限均可达10 ng·mL-1。

3.1.4 回收率与基质效应考察 取空白血浆50 μL，依次加入EC和Cya-EC的混合QC溶液10L，配制成相当于血浆浓度为20、200、1600 ng·mL-1的QC样品，每个浓度3个样本，进行LC-MS/MS分析，得到峰面积A。另取空白血浆50L，置1.5 mL 塑料EP管中，50L盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60 ℃水浴20 min，待反应结束后，加入50L甲醇，涡流混匀，离心10 min(15 000 r·min-1，4℃)，取上清液50L加入EC和Cya-EC的混合标准溶液3.3L、内标溶液6.7L和60L甲醇-水(50∶50，V/V)，配制成相应浓度，涡流混合，取5L进行LC-MS/MS分析，获得相应峰面积B。再另取50L超纯水，加入10L标准溶液、20L内标和50L盐酸巯乙胺溶液，加入50L甲醇，涡流混匀后，取上清液50L并用50L甲醇-水(50∶50，V/V)稀释后制备低、中、高3个浓度的无血浆基质样品，取5L进行LC-MS/MS分析，获得相应峰面积C。以峰面积A与峰面积B进行比较来评价EC、Cya-EC与内标回收率(R)，计算公式为R=A/B×100%；以峰面积B与峰面积C进行比较来评价EC、Cya-EC与内标基质效应(M)，计算公式为M=B/C×100%。

注：A.空白血浆；B.空白血浆中加入EC、Cya-EC(20 ng·mL-1)和Pro(100 ng·mL-1)；C.空白血浆中加入威麦宁提取物(20 g·mL-1)和Pro(100 ng·mL-1)；D.受试动物服用威麦宁胶囊后2 h的血浆样品图2 测定血浆中Cya-EC、EC和内标普萘洛尔的典型MRM色谱图

EC低、中、高3个浓度的提取回收率分别为(97.5±6.6)%、(94.4±8.3)% 、(89.5±6.7)%，Cya-EC低、中、高3个浓度的提取回收率分别为(83.8±7.3)%、(82.5±4.4)%、(88.5±2.4)%。EC、Cya-EC和内标基质效应和回收率结果见表2。

表1 EC、Cya-EC在比格犬血浆中方法学考察的准确度、精密度(n=6)

表2 EC、Cya-EC在比格犬血浆中方法学考察的基质效应和回收率

3.1.5 稳定性考察

3.1.5.1 室温放置2 h稳定性考察 取空白血浆50L，依次加入威麦宁提取物标准系列溶液10L，配制成相当于血浆浓度为0.2、2、20g·mL-1的威麦宁血浆样品，样品室温放置2 h后，依据2.4项下方法制备样品，室温放置2 h，每个浓度进行3个样本分析，测定样品质谱响应，并与新配制的同浓度威麦宁血浆样本质谱响应进行比较。结果表明所有室温放置2 h试验测定值与添加值的相对偏差RE在5.3% 之内。即血浆样品可以在室温放置2 h，保障了整个分析过程中的数据真实、可靠。

3.1.5.2 3次冷冻、解冻循环稳定性考察 取空白血浆50L，依次加入威麦宁提取物标准系列溶液10L，配制成相当于血浆浓度为0.2、2、20g·mL-1的威麦宁血浆样品，经反复3次-80 ℃冰冻，室温溶解后，依据2.4项下方法制备稳定性样品，每个浓度进行3个样本分析，测定样品质谱响应，并与新配制的同浓度威麦宁血浆样本质谱响应进行比较。结果表明所有3次冻融试验测定值与添加值的相对偏差RE在15%之内。即血浆样品可以进行反复3次冻融，保障了整个分析过程中的数据真实、可靠。

3.1.5.3 长期稳定性考察 取空白血浆50L，依次加入威麦宁提取物标准系列溶液10L，配制成相当于血浆质量浓度为0.2、2、20g·mL-1的威麦宁血浆样品，-80 ℃冰冻放置两个月后，依据2.4项下方法制备稳定性样品，每个浓度进行3个样本分析，测定样品质谱响应，并与新配制的同浓度威麦宁血浆样本质谱响应进行比较。结果显示，所有长期稳定性试验测定值与添加值的相对偏差RE在12.3% 之内，表明长期冰冻放置血浆样品，不影响本方法对样品浓度进行准确测定。

3.1.5.4 处理后样品4 ℃放置24 h稳定性考察 取空白血浆50L，按3.1.2项下操作，制备低、中、高3个浓度的QC样品(每浓度3个样本)，4 ℃放置24 h后进行稳定性考察，结果显示测定值与添加值的相对偏差RE在15%之内，说明分析测试过程中的样品稳定。

3.2 药代动力学数据

3.2.1 药时曲线 比格犬口服威麦宁胶囊后，根据EC和Cya-EC的血药浓度及计算得到的表儿茶素总血药浓度绘制药时曲线。EC、Cya-EC及表儿茶素总浓度的血药浓度-时间曲线分别见图3、4。

图3 比格犬口服威麦宁胶囊后表儿茶素及表儿茶素巯代物血药浓度-时间曲线(n=6)

图4 比格犬口服威麦宁胶囊后表儿茶素总血药浓度-时间曲线(n=6)

3.2.2 药动学参数 根据血浆-药物浓度数据，采用生物利用度研究数据处理通用程序(DAS3.0.2)计算药代动力学参数，采用梯形法计算AUC0-t值，以半对数作图法，由消除相的末端4个浓度点计算t1/2，Tmax和Cmax采用实测值，所得表儿茶素、表儿茶素巯代物及表儿茶素总量的药代动力学参数见表3。

4 讨论

威麦宁是以中药金荞麦中提取得到的鞣质部位为原料制成的中成药制剂，其主要活性成分是缩合鞣质。目前有关鞣质的研究多是针对其结构、含量测定方法和生物活性等方面[3]，对其在动物体内吸收、代谢的研究甚少。程小桂等[4-5]采用HPLC测定了原花青素B2和表儿茶素的含量，并采用同位素标记法研究了原花青素B2在大鼠体内的药代动力学；亦有报道涉及血浆中表儿茶素和儿茶素的含量测定[6-8]。但威麦宁的活性成分缩合鞣质是一类聚合物，无法按常规方法对其体内行为进行定量研究，所以本研究借鉴了刘刚等[2]报道的盐酸巯乙胺硫解法对威麦宁进行降解，对降解产物的主要成分表儿茶素和4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素在体内的代谢情况进行初步的研究。

表3 比格犬口服威麦宁胶囊后表儿茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素及表儿茶素总量的药代动力学参数

本研究采用巯乙胺硫解法结合超高效液相色谱串联质谱法，首次建立了同时测定比格犬口服威麦宁胶囊后，血浆中的表儿茶素和4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素的分析方法。在采用盐酸巯乙胺硫解的过程中，对盐酸巯乙胺加入体积、浓度及硫解反应温度、时间进行了考察，最后确定采用50L盐酸巯乙胺溶液(50 mg·mL-1)、60 ℃水浴20 min的效果最好。在UPLC液相条件优化过程中流动相采用乙腈-水(含0.1%甲酸)，比使用纯甲醇和乙腈分离效果好，进一步采用梯度洗脱优化分离效果并使峰形良好。因盐酸巯乙胺溶液配制采用浓盐酸-甲醇(1∶9)，酸性较强，对血浆中的蛋白沉淀也有一定作用，故采用了蛋白沉淀的方法对血浆样品进行前处理，简单易行。

在稳定性的考察试验中，给药后的血浆需经过盐酸巯乙胺硫解才能得到4β-(2-氨基乙硫基)表儿茶素，而血浆稳定性考察的是比格犬给药后待测组分在血浆中的稳定性，故只能加入威麦宁提取物，以模拟真实的血浆去考察待测物在血浆中的稳定性。

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SimultaneousDeterminationofEpicatechinand4β-2(aminoethylthio)EpicatechininDogPlasmabyUPLC-MS/MS

DAIWei1，FUShujun，CHANGXinquan1，WANGPeng3，4，5，HAOYu2，ZUOChenqiang5，SHIXiaona4，HEXin2

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorpo.，Beijing100195，China；2.FacultyofChineseMateriaMedica,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tainjin300193，China；3.TianjinKeyLaboratoryofearlydrugevaluationofinnovativedrugs，Tianjin300457，China；4.HarmoniaTestandTechnology(Tianjin)Co.，Ltd.，Tianjin300457，China；5.TianjinInternationalJointAcademyofBiomedicine，Tianjin300457，China)

Objective：To establish a sensitive and rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method to simultaneously determinate epicatechin(EC)and 4β-2(aminoethylthio)epicatechin(Cya-EC)in plasma of beagle dogs after oral administration of WeiMaiNing capsule.Method：Chromatographic separation was achieved on an Waters BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)using a step gradient program with the mobile phase of 0.1% formic acid aqueous solution and acetonitrile with 0.1% formic acid，at a flow-rate of 0.30 mLmin-1.Electrospray ionization(ESI)source was applied and operated in the positive ion mode.Multiple reaction monitoring mode with the transitions ofm/z291.1138.9(EC)，m/z366.1288.9(Cya-EC)andm/z260.2116.3(IS，propranolol)was performed to quantify，respectively.Results：The linear concentration ranges of calibration curves for EC and Cya-EC were 10-2000 ng·mL-1.The inter- or intra-day precision(RSD)was less than 14.82%，and the accuracy(RE)was within±4.86%.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS3.0.Thet1/2of EC and Cya-EC were 66.3 and 90.4 h.And the AUC0-∞of EC and Cya-EC were 2 114.7 and 12 909.5 ng·h·mL-1in beagle dog plasma after oral administration of WeiMaiNing capsules.Conclusion：The method was sensitive，rapid，convenient，using less plasma and was proved to be suitable for preclinical pharmacokinetic studies of EC and Cya-EC in beagle dog after oral administration of Wei MaiNing capsules.

Epicatechin；4β-2(aminoethylthio)epicatechin；UPLC-MS/MS；dog plasma

2016-06-30)

中国医药集团新产品开发基金(2011ZY01)

*

付淑军，工程师，研究方向：药物代谢与药物动力学；Tel：(022)65378888，E-mail：fushujun90@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.015