响应面法优化剪刀股中总皂苷的提取工艺

王威，孙晓丽

(1.河北省张家口市第三医院，河北 张家口 075000；2河北省易县妇幼保健院，河北 保定 074200)

响应面法优化剪刀股中总皂苷的提取工艺

王威1，孙晓丽2*

(1.河北省张家口市第三医院，河北 张家口 075000；2河北省易县妇幼保健院，河北 保定 074200)

目的：优化剪刀股中总皂苷的超声提取工艺，建立剪刀股中总皂苷的含量测定方法。方法：在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计，结合响应面分析法，以剪刀股总皂苷的提取率为评价指标，采用分光光度法，测定剪刀股中总皂苷的含量，采用Design-Expert v8.0.6软件对实验结果进行拟合和建模，确定剪刀股总皂苷超声提取的最佳工艺。结果：超声法提取剪刀股中总皂苷的最佳工艺为乙醇浓度80%，液料比18∶1，温度71 ℃，超声时间15 min，超声功率200 W，在此条件下，剪刀股中总皂苷提取率为1.744%，RSD=0.65%(n=6)。结论：该方法操作简便、准确、灵敏、重复性好，可作为剪刀股总皂苷的提取及含量测定方法。

剪刀股；总皂苷；超声提取；含量测定；响应面法

剪刀股(Ixeris debilis A.Gray)是菊科苦荬菜属植物剪刀股全草，以全草入药。具有清热凉血、利尿消肿的功能。用于肺热咳嗽、喉痛、口腔溃疡、急性结膜炎、阑尾炎、水肿、小便不利；外用治乳腺炎、疮疖肿毒、皮肤瘙痒[1]。马金萍[2]报道剪刀股醇提物可显著提高脑缺血再灌注损伤后小鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。蒲明秋等[3]报道剪刀股提取物可对抗烟碱引起的致癌作用。其活性成分的研究仅见剪刀股总黄酮的提取及含量测定[4]。本课题组在前期研究发现，剪刀股中含有一定量的皂苷类成分。近年来，可见有关菊科植物中皂苷类成分的提取分离及生物活性的研究报道[5-8]。目前，有关剪刀股总皂苷提取工艺的研究尚未见报道。本研究采用超声辅助法提取剪刀股总皂苷，并采用响应面法对其提取工艺进行优化，为剪刀股的开发利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

UV2800双光束紫外可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司)；KH5200DE型高功率数控超声波清洗器(昆山市禾创超声仪器有限公司)；FA1204B电子分析天平(上海精科天美贸易有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药品

剪刀股采自河北省张家口市赤城县，由河北北方学院赵恒诚教授鉴定为正品。齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110709-201206)；其他试剂均为国产分析纯；实验用水为三重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸2.0 mg于10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，即得浓度为200 μg·mL-1的齐墩果酸对照品溶液，避光放置备用。

2.2 供试品溶液的制备

将干燥的剪刀股粉碎后过20目筛，60 ℃干燥至恒重。精密称取剪刀股粉末2.5 g，加25 mL石油醚，水浴加热回流2 h，过滤，挥干至无石油醚味，置于锥形瓶中，加80%乙醇40 mL，于60 ℃超声(Hz=120 W)，辅助提取10 min，过滤，滤液用体积比为1∶5的水饱和正丁醇萃取，萃取3次，合并滤液，蒸干溶剂，用热无水乙醇溶解，定容至25 mL[9]，在提取工艺研究中改变相应参数。

2.3 测定波长的选择

精密量取对照品及供试品溶液0.5 mL于10 mL具塞试管中，挥干溶剂，分别加入新配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60 ℃水浴下反应20 min，冷却后加入冰醋酸定容至10 mL，于200～600 nm进行波长扫描[10]，结果显示，对照品和供试品均在546 nm处有最大吸收，故选择546 nm为测定波长。

2.4 标准曲线的制备

精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL对照品溶液于10 mL具塞试管中，按2.3项下显色，在546 nm处测量吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=39.372X-0.063 1，r=0.999 9(n= 6)，结果表明，齐墩果酸浓度在4～24 μg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验

精密吸取相同供试品溶液5份，每份1 mL，分别于室温放置0、2、4、6、8、10 h后，依法测定吸光度A。A的RSD值为1.97%，表明供试品溶液室温放置10 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

同一批样品5份，每份2.5 g，精密称定，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3项下方法测定吸光度A。A的RSD为0.89%，结果表明该方法重复性良好。

2.7 精密度试验

精密吸取对照品溶液1 mL，按2.3项下操作，连续5次测定吸光度A。A的RSD为 1.22%，结果表明该方法仪器精密度良好。

2.8 加样回收试验

取重复性试验所用的同批样品(已知含量1.72%)约2.5 g，共5份，精密称定，加入适量的齐墩果酸对照品，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3项下方法测定吸光度，计算加样回收率。平均加样回收率为99.62%，RSD为1.91%(n=5)，表明该方法测得的结果准确可靠。

2.9 单因素试验设计

以总皂苷提取率为考察指标，按照上述总皂苷提取工艺，固定其他条件，分别考察不同乙醇浓度、液料比、提取温度、超声时间、超声功率对剪刀股总皂苷提取率的影响。

由图1(A)可知，随着乙醇浓度的增加，剪刀股总皂苷的提取率不断增加，当乙醇浓度达到80%时，总皂苷提取率达到最大，继续增加乙醇浓度，总皂苷提取率明显下降，因此乙醇浓度选择在75%～85%进行优化。

由图1(B)可知，随着液料比的增大，剪刀股总皂苷的提取率增加，但当液料比超过20∶1后，总皂苷提取率变化不明显，为节约溶剂，因此液料比选择在16∶1～20∶1进行优化。

由图1(C)可知，随着提取温度的提高，剪刀股总皂苷的提取率不断增加，当提取温度达到75 ℃时，总皂苷提取率达到最大，继续提高温度，总皂苷提取率略有下降，因此提取温度选择在65～75 ℃进行优化。

由图1(D)可知，超声提取时间增加至15 min后，剪刀股总皂苷提取率不随提取时间变化而变化，因此，选择超声提取时间为15 min。

图1 剪刀股总皂苷提取的单因素试验

由图1(E)可知，在200～400 W随着超声功率的增加，剪刀股总皂苷的提取率变化不明显，在本实验中，采用200 W功率。

2.10 Box-Behnken试验设计及响应面分析

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计方案，以乙醇浓度A、液料比B、提取温度C为考察因素，以剪刀股总皂苷提取率为响应值，利用Design-Expert v8.0.6软件优化剪刀股总皂苷提取工艺[11]。试验因素、水平编码见表1。设计方案及结果见表2，拟合二次多项式模型的方差分析见表3。对表2中的数据进行多元回归拟合，获得剪刀股总皂苷提取率对自变量乙醇浓度A、液料比B、提取温度C的二次多项回归方程为：

Y=1.72+0.025A+0.016B+0.056C+0.018AB-0.077AC+0.11BC-0.25A2-0.19B2-0.13C2。

表1 因素与水平

表2 Box-Behnken试验设计方案与结果

注：表2中实验1～12为析因实验；13～17为中心实验。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析

注：***P<0.001表示差异极显著；**P<0.01表示差异高度显著；*P>0.05，表示差异不显著。

回归方程响应面及等高线见图2(a～c)，任何两个交互因素的响应面都存在最高点，即在所选的范围内存在极值，说明各因素考察范围较为适当。响应面曲面的坡度的陡峭程度直接地反映了在处理条件发生变化时剪刀股总皂苷提取量的响应灵敏程度。由图可见，乙醇浓度和提取温度对剪刀股总皂苷提取率影响高度显著，三个因素影响大小顺序为温度>乙醇浓度>液料比。等高线均为椭圆形，表明AB、BC、AC均有交互作用，由于AB的等高线更接近于圆形，因此乙醇浓度和液料比交互作用最弱，提取温度与乙醇浓度、提取温度与液料比的交互作用较为显著。

通过软件分析得到最佳提取工艺：乙醇体积分数为80.07%、液料比为18.23 mL·g-1，提取温度为71.29 ℃，在此条件下剪刀股总皂苷的提取率为1.732%。为使实验操作简便，最终确定提取工艺：乙醇体积分数为80%、液料比为18 mL·g-1、提取温度为71 ℃。

2.11 验证试验

精密称取剪刀股6份，每份20 g，按2.2项下方法以最佳的提取工艺(乙醇体积分数为80%、液料比18∶1、超声温度71 ℃、超声时间15 min、超声功率200 W)提取总皂苷，按2.3项下方法显色，546 nm处测定吸光度，总皂苷含量分别为1.731%、1.734%、1.733%、1.745%、1.742%、1.776%，平均含量为1.744%，RSD为0.65%，表明该方法适合于放大生产。

图2 各交互因素对剪刀股总皂苷提取率的响应面图

3 讨论与结论

皂苷的提取主要方法为溶剂回流法，所用时间较长，不利于皂苷类成分的稳定，本文通过预实验采取超声辅助提取法提取剪刀股总皂苷，在较短时间内即可完成提取，避免因提取时间过长而使皂苷被水解破坏[12]。

本文在单因素试验的基础上，将响应面法应用于优化剪刀股活性成分总皂苷的提取。实验结果表明，乙醇浓度、提取温度、液料比的平方项，提取温度与乙醇浓度、提取温度与料液比的交互作用对剪刀股总皂苷的提取率的影响显著。说明乙醇浓度、提取温度、液料比对剪刀股总皂苷提取率的影响不是简单的线性关系。

回归分析和验证实验结果表明，此方法合理可行。得到剪刀股总皂苷提取的最佳条件：乙醇体积分数为80%、液料比为18∶1、超声温度为71 ℃、超声时间为15 min、超声功率为200 W，剪刀股总皂苷提取率为1.732%。

该方法简便易行、灵敏度高、精密度高、重复性好，稳定可靠，可作为剪刀股中总皂苷的提取及含量测定方法；为以后剪刀股总皂苷的提取和含量测定提供了方法与理论依据，为新药开发和工业化生产提供了实验基础。

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OptimizationofExtractionProcessforTotalSaponinsfromIxerisdebilisbyResponseSurfaceMethodology

WANG Wei1，SUNXiaoli2*

(1.PharmacyofThe3thHospitalofZhangjiakou，Hebei，Zhangjiakou，75000，China；2.WomenandChildrenHospitalofYixian，Hebei，Baoding，074200，China)

Objective：To optimize theextraction of total saponinsand establish a method for determination of total saponins inIxerisdebilis.Method：Using the extraction yield of total saponins as index，spectrophotometric method was used to determinate the content of total saponins inI.debilis.On the basis of single factor experiments，Box-Behnken design and response surface were used to optimize theextraction of total saponins.And the extraction yield of the total saponins wasanalyzedusing quadratic regression modelby the software of Design-Expert v8.0.6.Result：The optimum extraction conditions were：ethanol concentration 80%，liquid to material ratio 18 mL·g-1，temperature 71 ℃，extraction time 15 min and the ultrasonic power 200 w.Under these conditions，the yield of extracted total saponinscould be up to 1.744%，RSD=0.65%(n=6).Conclusion：The method is simple，accurate，sensitive andreproducible，and can be used for extraction and content determination of total saponins fromI.debilis.

IxerisdebilisA.Gray；total saponins；ultrasonic-assisted extraction；content determination；response surface methodology

] 孙晓丽，副主任药师，研究方向：临床药学，E-mail：xiaoli_sunbaoding@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.024

2016-10-31)

*[