基于ITS2序列的朱砂根及其混伪品分子鉴定△

陈新连，周建国，马双姣，姚辉，林余霖，王瑀

(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

基于ITS2序列的朱砂根及其混伪品分子鉴定△

陈新连，周建国，马双姣，姚辉，林余霖，王瑀*

(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：应用ITS2序列对朱砂根及其混伪品进行鉴定研究，为中药临床准确用药、市场规范化管理等提供依据和保障。方法：对朱砂根及其混伪品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列、双向测序，对序列进行比对、计算遗传距离。结果：朱砂根ITS2序列长度为217 bp，种内有10个变异位点，有9种单倍型，平均G+C含量为59.1%，除变种红凉伞外，朱砂根与其各混伪品的种间最小遗传距离均大于朱砂根种内最大遗传距离，所以利用ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品。结论：实验结果表明ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品，但对于其与变种的关系需进一步研究。

朱砂根；鉴别；ITS2序列；DNA条形码；混伪品

中药材朱砂根为紫金牛科植物朱砂根ArdisiacrenataSims的干燥根。本品根簇生于略膨大的根茎上，呈略弯曲的圆柱形，表面灰棕色或棕褐色，有多数纵皱纹和横环状断裂痕，皮部与木部易分离。质硬而脆，易折断，断面不平坦，皮部厚，约占断面的1/3～1/2，类白色或粉红色，外侧有紫红色斑点散在，习称“朱砂点”，木部黄白色，不平坦。气微，味微苦，有刺舌感，有解毒消肿、活血止痛、祛风除湿之功效[1]。朱砂根为民间常用中草药之一，根、叶可用于跌打风湿、消化不良、咽喉炎及月经不调等症。果可食，亦可榨油，油可供制肥皂。朱砂根也可作观赏植物，在园艺方面的品种较多[2]。此外，其在抗炎抑菌、抗肿瘤、抗生育、抗HIV、抑制血小板聚集、降低血压等方面也有很好的疗效[3-7]。

在第四次全国中药资源普查中发现，朱砂根野生资源目前较为丰富，主要分布于长江中、下游的重庆、四川、贵州、云南、广东和广西等地，药用方面基本全部来源于野生朱砂根[8]。朱砂根常与其同属植物混在一起使用[9-10]，同时，由于牡丹皮和山豆根市场价格较高，三者的外部形态相似，有不法商贩将朱砂根混在牡丹皮、山豆根中使用[10-12]，牡丹皮是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的根皮，为清热凉血、活血化瘀之药[1]，山豆根是豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的根及根茎，有清热解毒、消肿利咽的作用[1]。此混伪现象严重影响了临床的安全用药和药材的规范化管理、流通。中药材的传统鉴别方法较难区分此类混伪品，且过度依赖专业人员的主观判断，而DNA条形码鉴定技术是利用基因组中一段公认相对较短的序列进行特异性物种识别鉴定，可有效弥补传统鉴别的局限，其自2003年被提出后就受到国际广泛关注[13]。该技术物种鉴定效率高，且技术方法简单，稳定性好、可重复性强，不受外界环境以及样品形态和材料部位的限制，显著提高了鉴定的效率与准确性。其中，对于植物类药材，ITS2序列具有很高通用性，易于扩增、测序，且长度适宜，约230 bp，同时也具有足够的变异以区分不同的物种，绝大多数中药材可以通过ITS2序列进行鉴定[14-15]。本研究应用ITS2序列对朱砂根及其混伪品进行鉴定研究，以期为其临床用药安全提供依据。

1 材料

朱砂根样品包括基原植物样本、药材样本、种子样本、复核样本和对照药材等，采自广东、江西、湖北、安徽、四川等地，种子样本来自国家药用植物种质资源库。此外，还从GenBank下载了部分物种的ITS2序列，所有下载序列应用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法在NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和中药材DNA条形码鉴定系统(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)进行验证，确保准确可靠。具体的样本信息见表1。

表1 朱砂根及其混伪品样品信息表

2 方法

2.1 DNA提取

将根类样品用75%乙醇棉擦拭干净，取约40 mg样品，取变色硅胶干燥基原植物叶片样品约20 mg，朱砂根的种子呈球形，直径约为6～9 mm，在靠近种皮的位置取样约40 mg，磨碎，用植物基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取总DNA，加裂解液，叶片样品65 ℃水浴2 h，其余样品56 ℃水浴8～12 h，主要原理是通过使细胞壁、细胞膜溶解破裂，DNA暴露，再经过多步除杂、沉淀、清洗、吹干、洗脱等过程，去除酚类、蛋白质、RNA等，最终得到较为纯净的总DNA备用。

2.2 PCR扩增及测序扩增

选用25 μL体系，参照Chen等的研究方法[16]，所用引物为正向ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和反向ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，用12.5 μL 2×Taq Master Mix(北京艾德莱生物科技有限公司)，正反向引物各取1 μL，DNA模板2 μL，用8.5 μL ddH2O补足体积至25 μL。扩增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s，40个循环；72 ℃，10 min。扩增完成后，用凝胶成像仪在紫外光下观察其电泳后在琼脂糖凝胶中的条带亮度，并与Marker AL2000(北京艾德莱生物科技有限公司)对比来判断扩增情况，包括目的条带的有无、估算产物浓度及序列长度[17]。最后将PCR产物送往中国农业科学院开放实验室进行双向测序。

2.3 数据处理获得的测序结果

应用CodonCode Aligner 5.1.5进行拼接，去除低质量区，然后基于隐马尔科夫进行ITS2序列注释，最后用MEGA6.0 (MolecularEvolutionary Genetics Analysis) 进行种内种间变异位点、遗传距离的分析。基于本课题组自行编写的代码[18-19]，将朱砂根及其主要混伪品牡丹皮、山豆根的主导单倍型ITS2序列转换为DNA条形码和二维DNA条形码图片。

3 结果与分析

本研究获得朱砂根ITS2序列48条，长度为217 bp，G+C含量为58.5%～60.2%，平均G+C含量为59.1%，种内变异位点10个，有9个单倍型，主导单倍型占50%，朱砂根种内变异位点具体信息见表2。

表2 朱砂根ITS2序列种内变异位点

注：*表示与第一行碱基相同，-表示碱基缺失。

朱砂根主导单倍型(以ZHSG0005为例)与其同属植物ITS2序列比对长度为217 bp，共有25个变异位点，详细信息见图1。朱砂根与其混伪品种间序列比对长度为249 bp，有142个变异位点。

朱砂根种内及其与各混伪品间的K2P距离请见表3。由表3可以看出，除变种红凉伞外，朱砂根与其他各混伪品的种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离，因此用ITS2序列可以区分鉴别开。

注：.表示与第一行碱基相同。图1 朱砂根主导单倍型与其同属植物ITS2序列种间变异位点

表3 朱砂根种内及其与各混伪品的K2P距离

朱砂根及其主要混伪品牡丹皮、山豆根的药材饮片图片、主导单倍型ITS2序列DNA条形码和二维DNA条形码图片见图2。其中DNA条形码和二维DNA条形码图片中以不同颜色代表不同的核苷酸，数字表示碱基序列长度，右侧部分二维码图片为物种拉丁名和DNA条形码序列转换而成，形象化展示各物种的DNA条形码。通过移动终端(如手机等)上的二维码扫描软件可以识读获得物种拉丁名及ITS2序列信息，可通过移动终端上的网页浏览器登录中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)进行物种鉴定。

图2 朱砂根、牡丹皮和山豆根药材图片及其对应基原的DNA条形码和二维DNA条形码图片

4 讨论

根类药材细胞中含大量次生代谢产物，如多糖和多酚，这些物质在DNA提取过程中与DNA共沉淀，形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变[20]；同时，种子类样品富含油脂、酚类、多糖类等物质，会干扰DNA的提取，所以提取时应适当增大取样量，增大裂解液的用量，延长水浴时间，尽可能提取较高质量的DNA，利于实验的进行，在研磨前加大聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)的用量，并在加裂解液前用核分离液[100 mmol·L-1Tris-HCL(pH 8.0)，20 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)，0.7 mmol·L-1NaCl，2% PVP-40，0.4%β-巯基乙醇]多次洗涤、离心至上清液不呈黏稠状。之前就有很多研究者在实验时进行过相似的处理[21-23]。

红凉伞是朱砂根的变种，朱砂根种内最大遗传距离(0.031 3)大于红凉伞与朱砂根的种间最小遗传距离(0)，因而无法从ITS2序列水平鉴别这两种植物。根据《中国植物志》记载，二者作为单独的两个种是不恰当的，故给予归并[2]。《中国植物志》记录两者植物形态上的主要区别是，变种的叶背、花梗、花萼及花瓣均带紫红色，有的植株叶两面均为紫红色，两者在植株外形无太大差异，仅颜色不同，从标本上看，尤其是在野外采集记录不详而标本压制不得当时，二者更是无法区别，而活的植株中，颜色的深浅也有过渡，并且二者在药用性能方面基本一致[2]。在最新版的《Flora of China》中，红凉伞已合并至朱砂根。对于朱砂根与其变种的鉴别，目前还没有找到合适的方法，答国政等[24]基于ITS2序列对紫金牛属矮地茶药材进行基因识别研究时，也发现朱砂根和红凉伞在NJ树中混为一支，无法鉴别分开。徐玲玲等[25]基于核ITS与叶绿体trnL-F序列对12种紫金牛属植物的种间关系与变异进行的研究，为朱砂根与其同属其他植物鉴定提供了启示。随着测序技术的发展，应用叶绿体全基因组筛选特异性DNA序列[26]对二者进行区分，或将叶绿体全基因组作为超级条形码对二者的关系进行深入的研究。

药用植物栽培过程中，种子是最基础、最重要的起点[27]，本实验对朱砂根不同产地种子进行了鉴别研究，为朱砂根的规范化栽培、种子质量标准的制订提供了很好的依据。此外，本实验方法简单易掌握，适用于较多物种及其混伪品的鉴定。它从分子角度入手，植物的遗传物质相对稳定，较少甚至不受到材料部位、外界环境的影响，逐渐摆脱了对于专业鉴定人员的依赖，使物种鉴定标准化、简单化。此外，本研究转成的二维DNA条形码图片，读者可以通过多种二维码扫描软件(如微信“扫一扫”功能、“快拍二维码”等)识读到对应物种的拉丁名和ITS2序列。本研究利用DNA条形码对朱砂根及其混伪品进行鉴定，对于物种鉴定有重要的启示与指导意义，对于其在临床准确安全用药和规范药材市场流通等方面提供了重要依据。

致谢：感谢中国中医科学院中药研究所对部分样品进行复核，感谢国家药用植物种质资源库提供种子样本。

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MolecularIdentificationofArdisiaeCrenataeRadixandItsAdulterantsBasedonITS2Sequence

CHEN Xinlian，ZHOUJianguo，MAShuangjiao，YAOHui，LINYulin，WANGYu*

(TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：This research aims to identify Ardisiae Crenatae Radix and its adulterants accurately using the ITS2 sequence.It will provide the foundation for its clinical medication and accurate market standardized management.Methods：Ardisia Crenatae Radix and its adulterants were identified and distinguished by ITS2 barcode，one marker of DNA barcoding.Genomic DNA ofArdisiacrenataand its adulterants were extracted and then the ITS2 regions were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.The ITS2 sequences were aligned and the genetic distances were computed using MEGA 6.0 in accordance with the Kimura 2-parameter (K2P) model.Results：The length ofA.crenatasequence is 217 bp and the average G+C content was 59.1%.There were ten variable sites of the ITS2 regions ofA.crenataand 48 ITS2 sequences ofA.crenataincluded nine haplotypes.Except forA.crenatavar.bicolor，the maximum intra-specific K2P genetic distance of Ardisiae Crenatae Radix and its adulterants was less than the minimum inter-specific K2P genetic distance.Conclusion：The experimental results indicated that the ITS2 sequence could be a good marker to identify Ardisia Crenatae Radix and its adulterants.But the relationship ofA.crenataandA.crenatavar.bicolorneed to be further studied.

Ardisiae Crenatae Radix；identification；ITS2 sequence；DNA barcoding；adulterants

国家科技支撑计划(2011BAI07B08)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-3-016)

] 王瑀，副主任技师，研究方向：中药资源；Tel：(010)57833199，E-mail：ywang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.008

2017-03-23)

*[