消痰散结方对结肠癌干细胞样细胞凋亡的影响及相关机制研究

周昱岐+张映城+魏品康

[摘要] 目的 探讨消痰散结方对结肠癌干细胞样细胞（CCSCs）凋亡的影响及相关机制。 方法 采用无血清培养法由HCT116结肠癌细胞诱导培养CCSCs，通过检测CCSCs标志物CD44进行鉴定。消痰散结方浸膏冻干粉末溶解在细胞培养液中，制备消痰散结方保存液。以不同浓度消痰散结方（0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL）作用CCSCs 72 h，Annexin-V/PI双染色结合流式细胞术检测各浓度消痰散结方对CCSCs的影响。Western blot检测药物干预后Bax、Bcl-2蛋白表达变化。 结果 HCT116细胞在无血清培养下成球生长，CCSCs中CD44+细胞占（49.69±1.89）%。消痰散结方可诱导CCSCs，其凋亡率与对照组（0 mg/mL）比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其凋亡效应呈浓度依赖性。消痰散结方作用后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax表达增强，抑凋亡蛋白Bcl-2表达减弱，以0.5、1.0 mg/mL两组浓度效应更为显著。 结论 从HCT116结肠癌细胞成功诱导富集CCSCs，消痰散结方能剂量依赖性地诱导CCSCs，其机制可能与促凋亡蛋白Bax表达增强、抑凋亡蛋白Bcl-2表达减弱相关。

[关键词] 消痰散结方；结肠癌干细胞样细胞；凋亡；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate effect of Xiaotan Sanjie Recipe on apoptosis of colon cancer stem-like cells （CCSCs） and its related mechanism. Methods The CCSCs were induced from colon cancer cell line HCTl16 in serum-free medium. The expressions of CD44 were detected to identify CCSCs. The lyophilized powder of Xiaotan Sanjie Recipe Extract was dissolved in cell culture fluid， so as to make preserving fluid of Xiaotan Sanjie Recipe. CCSCs were treated with different concentrations of Xiaotan Sanjie Recipe （0.125， 0.25， 0.5， 1.0 mg/mL） for 72 h. The effects of different concentrations of Xiaotan Sanjie Recipe for CCSCs were detected by Annexin-V/PI staining combined with flow cytometry. The expression changes of Bax， Bcl-2 protein after drug intervention were detected by Western blot. Results HCT116 cells formed cancer stem cell spheres in serum-free medium. The proportion of CD44 cells in cell spheres was （49.69±1.89）%. Xiaotan Sanjie Recipe could induce the cell apoptosis， the apoptosis rate was statistically significant different compared with the control group （0 mg/mL） （P < 0.05）， the apoptotic effects showed concentration-dependent. After application of Xiaotan Sanjie Recipe， the expression of pro-apoptotic protein Bax of Bcl-2 family was increased， meanwhile the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was decreased. The effect was more pronounced in 0.5 mg/mL and 1.0 mg/mL concentration groups. Conclusion CCSCs are successfully induced from HCT116 colon cancer cell line. Xiaotan Sanjie Recipe can induce CCSCs in a dose-dependent manner， the mechanism may be related to the increased expression of pro-apoptotic protein Bax and decreased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2.

[Key words] Xiaotan Sanjie Recipe； Colon cancer stem-like cells； Apoptosis； Bax protein； Bcl-2 protein

結直肠癌每年有120万新发病例和60万死亡病例[1]。我国晚期结直肠癌即使行根治性切除后5年生存率为40%～50%[2]。结肠癌干细胞突变于正常的结肠隐窝干细胞[3]，具有自我更新、高度增殖潜能[4]、高致瘤性[5]、强耐药性[6]及多向分化的特点，因此有效杀伤肿瘤干细胞的药物及靶点，成为肿瘤研究中的一个重要方向。中药复方消痰散结方是著名肿瘤专家魏品康教授的临床验方，临床及基础实验证实疗效明确[7-8]。本研究将肿瘤干细胞研究与中药复方消痰散结方结肠癌研究相结合，旨在进一步探索消痰散结方是否能成为清除肿瘤干细胞的靶向药物。endprint

1 材料与方法

1.1 细胞株

HCT116人结直肠癌细胞株，购自中国科学院上海生科院细胞库。培养条件37℃、5%CO2；培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 pg/mL链霉素的McCoy′s 5A培养基；用含0.01% EDTA的0.25%胰酶进行消化传代，细胞处于对数生长期后用于实验。

1.2 药物

消痰散结方由天南星、法半夏、全蝎、蜈蚣、鸡内金、茯苓、山慈菇、蚤休、枳实、陈皮、白芥子、炙甘草12味中药组成，中药饮片购自上海雷允上公司，第二军医大学附属长征医院制剂室水蒸醇提法制备浸膏，原药材浓度为3.35 g/mL。消痰散结方冻干粉末保存液制备[9]：将消痰散结方浸膏在超净水中稀释5倍，16 000 r/min，离心半径20 cm，离心10 min，取上清液，-80℃制备冻干粉末，称重，溶解在细胞培养液中制备保存液，0.22 μm膜过滤，保存液药物浓度为10 mg/mL（原药材浓度为0.22 g/mL）。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清（奥地利PAA Laboratories GmbH公司）；McCoy′s 5A培养基、Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium（DMEM）/F12培养基；B27supplement（均为美国GIBCO公司）；表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美国PeproTech公司）。鼠抗人GAPDH一抗（美国Proteintech，货号60004-1-Ig），兔抗人Bcl-2一抗（美国SAB，货号#35342）、兔抗人Bax一抗（美國SAB，货号#34260），Annexin-V/FITC细胞凋亡试剂盒（美国BD公司，Cat No.556547）。CO2细胞培养箱（美国Forma Scientific公司）；倒置显微镜（日本Nikon公司，TS100）；Model Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统；流式细胞仪（美国BD公司，EPICS-XL型）。

1.4 HCT116结肠癌干细胞培养及鉴定

取HCT116细胞接种于含20 μL/L EGF及20 μL/L bFGF的无菌无血清DMEM/F12培养基（serum free medium，SFM）中，最终细胞数为4×103/mL，37℃、5%CO2培养箱中培养。分别于培养第3、5、7天在倒置显微镜下观察和拍摄，待细胞完全贴壁形态改变时，停止培养。将PE标记的CD44抗体加入细胞悬液中，流式细胞仪检测CD44表达情况。

1.5 细胞分组与干预方法

各实验组加入消痰散结方保存液，使药物终浓度为0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，37℃、5%CO2培养箱中药物作用72 h。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 Annexin-V/PI双染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡 收集细胞培养液，加入500 μL 0.25%胰酶（不含EDTA），37℃、5%CO2培养箱中消化3～5 min，中止消化反应移至流式管中，1500 r/min×5 min离心，按9∶1的比例用PBS稀释试剂盒中缓冲液（10×），沉淀细胞内加入缓冲液（1×），检测管中加入试剂盒中FITC Annexin-V 3.8 μL，室温反应10 min，加入试剂盒中碘化丙啶3.8 μL，加入120 μL缓冲液（1×）。检测细胞凋亡，以FITC荧光信号读数为横坐标，PI荧光信号读数为纵坐标。

1.6.2 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2） 细胞裂解后按产品说明用BCA法测定蛋白浓度，等量的蛋白样品（40 μg）经10% SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，GAPDH一抗按1∶5000稀释，Bax、Bcl-2一抗按1∶1000稀释，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次后，加入1∶2000稀释的HRP标记的羊抗鼠或羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST再次洗涤3次，加入ECL发光底物，在WB凝胶成像系统中成像、摄图。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，Levene法检验方差齐性，多组均数间比较采用单因素方差分析，各实验组与对照组比较采用Dunnett-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCT116结肠癌干细胞富集培养及鉴定

置于SFM培养后，HCT116细胞呈卵圆形，且聚集成球，于培养液中悬浮生长。同时经流式细胞仪检测结肠癌干细胞样细胞（CCSCs）表面标志物CD44表达情况，发现CD44+占（49.69±1.89）%，成功富集了CCSCs。见图1～2。

2.2 消痰散结方诱导结肠癌干细胞凋亡

消痰散结方作用于CCSCs 72 h的IC50是0.25 mg/mL，故取以下4个浓度：0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，作用CCSCs 72 h后，Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡。结果显示，从0.125 mg/mL浓度起，消痰散结方即诱导CCSCs凋亡，其凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；随着药物作用浓度增高，细胞凋亡率也逐渐增高（P < 0.01），效应呈浓度依赖型。见图3～4。

2.3 消痰散结方对结肠癌干细胞凋亡相关蛋白表达的影响

消痰散结方作用于CCSCs 72 h，WB检测细胞凋亡相关蛋白的表达。结果显示，消痰散结方作用后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax表达增强，抑凋亡蛋白Bcl-2表达减弱，以0.5 mg/mL及1.0 mg/mL浓度组更为显著。见图5。endprint

3 讨论

结肠癌属中医学的“肠积”“锁肛痔”等病的范畴。笔者所在学科为国家中西医结合重点学科，长期致力于中西医结合防治消化道肿瘤，总结临床实践发现：发生肠癌的三大外因（外感湿热、饮食不节、情志所伤），其本质皆可归结于“痰”。第一，外感湿热，导致水湿困脾，脾失健运，则湿聚为痰，内外之痰湿日久不去，发为肠癌。第二，现代人多食膏粱厚味，日久损伤脾胃，滋生痰湿，痰湿不去化热，下迫大肠，与肠中之糟粕交阻搏击，日久成块。第三，情志所伤所愿不遂，肝气郁结，肝木太过克伐脾土，脾失健运，水湿内生，郁而化热，痰热合邪，下迫大肠，诱生肠癌[10-11]。基于此，我们制订消痰散结法为治疗肠癌侵袭转移的主要法则，消痰散结方为其代表方，方以法半夏、天南星辛温苦燥，善消痰燥湿共为君，蜈蚣、全蝎等解毒散结通络共为臣，陈皮理气和胃、鸡内金助胃之消导而为佐，炙甘草温中健脾，调和诸药为使，运用于临床实践证实，消痰散结法是治疗晚期肠癌的有效方法之一[7-8]。笔者前期研究发现，消痰散结方可显著抑制肠癌HCT116亲代细胞增殖，促进凋亡，并且阻滞其细胞周期[12-13]。

肠癌干细胞突变于正常的结肠隐窝干细胞，故其具有干细胞和肿瘤细胞的双重特性，被认为具有肿瘤发生能力的肿瘤细胞亚群[5]。无血清培养基培养法为目前常用的分离肿瘤干细胞的体外研究方法，来源于用“干细胞培养基”筛选神经干细胞的方法，原理是良性肿瘤细胞和已分化癌细胞在“无血清超低黏附”培养条件下，会因为缺乏营养物质和失巢凋亡而死亡，只有未分化癌细胞能够在其中存活、增殖，形成悬浮集群并最终形成球体[14]。它既是体外CCSCs的识别方法，又是CCSCs的富集方法[15]，本实验培养分选HCT116细胞的肠癌干细胞，并通过流式检测肿瘤干细胞表面标志物CD44，进行验证。有实验证实，采用Ad-CD44-shRNA方法敲低HCT-116细胞的CD44表达后，发现细胞增殖、迁移和侵袭显着减少，细胞凋亡增加[16]。实验进一步采用消痰散结方冻干粉溶解液作用于肠癌干细胞，观察到消痰散结方对肠癌干细胞有促凋亡作用，并且凋亡率随作用浓度升高而增加。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，细胞凋亡信号调控异常、引起细胞过度积累是导致癌症发生的机制之一[17]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡信号转导中发挥重要作用[18]，据功能不同Bcl-2家族分为促凋亡蛋白（如Bax）和抑凋亡蛋白（如Bcl-2），基础研究显示，Bax、Bcl-2对肿瘤干细胞增殖有明确的作用[19-20]。消痰散结方体外作用肠癌干细胞后，促凋亡蛋白Bax表达增强，抑凋亡蛋白Bcl-2表达减弱，并呈浓度依赖性，消痰散结方诱导结肠癌干细胞凋亡的机制与对Bcl-2蛋白家族的调控相关。

综上所述，本研究提示从HCT116结肠癌细胞成功诱导培养出CCSCs，消痰散结方能剂量依赖性地诱导CCSCs凋亡，其机制可能与促凋亡蛋白Bax表达增强、抑凋亡蛋白Bcl-2表达减弱相关，为阐明消痰散结方抗结肠癌的分子靶点提供了一定依据。

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（收稿日期：2017-05-19 本文編辑：张瑜杰）endprint