冻融PESA精子结合ICSI技术在治疗梗阻性无精子症中的应用研究

葛 斌，杨智敏，王露娟，杨名慧

(遵义医学院附属医院 生殖中心，贵州 遵义 563099)

临床医学研究

冻融PESA精子结合ICSI技术在治疗梗阻性无精子症中的应用研究

葛 斌，杨智敏，王露娟，杨名慧

(遵义医学院附属医院 生殖中心，贵州 遵义 563099)

目的冻融PESA精子结合ICSI技术在治疗梗阻性无精子症中的应用研究。方法回顾性分析本生殖中心使用新鲜PESA精子、冻融PESA精子、新鲜体外射精精子行ICSI治疗共193周期，比较受精、发育情况和临床结局。结果3组ICSI治疗后受精率分别为94.67%、93.50%、95.54%，3组间无统计学差异(P>0.05)；正常卵裂率分别为：93.29%、91.89%、94.78%，3组间无统计学差异(P>0.05)；优质胚胎率分别为：39.49%、37.07%、43.49%，3组间无统计学差异(P>0.05)；妊娠率分别为：42.42%、37.84%、41.11%，3组间无统计学差异(P>0.05)；流产率分别为：10.71%、7.14%、13.51%，3组间无统计学差异(P>0.05)；结论冻融PESA精子能达到新鲜精子相似的临床结果，安全有效。

精子冷冻；经皮附睾抽吸精子；卵胞浆内单精子注射

梗阻性无精子症是指患者有生精功能，但是由于生精小管到射精管的排精通道堵塞，射精后精液中无法检测出精子的一种男性不育疾病，占男性不育症的10%左右[1]。将经过附睾穿刺(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)获得的精子行卵母细胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是目前治疗梗阻性无精子症的唯一办法[2]。若将上一周期的剩余附睾穿刺精子进行冻融保存，可以减少反复附睾穿刺带来的并发症，而且能最大限度保存男性生育力。但是对于冷冻后的PESA精子其临床结局如何，目前报道较少。作者回顾性比较复苏后的冷冻PESA精子其受精能力、胚胎发育潜能和临床结局与新鲜PESA精子及新鲜体外射精精子之间的差异，来探讨冻融PESA精子的临床效果，并为临床补充理论依据。

1 对象与方法

1.1 一般资料 选取2014年10月至2016年11月在我院生殖中心进行新鲜PESA精子、冻融PESA精子、新鲜体外射精精子行ICSI治疗共193周期，其中新鲜PESA精子治疗组66例，冻融PESA精子治疗组37例，新鲜体外射精精子治疗组90例。相同手术操作均为同一技术人员，避免人为因素影响。

1.2 方法

1.2.1 降调节、促排卵和取卵： 根据患者配偶的雌二醇、黄体生成素和卵泡生成素情况，采用长方案促排卵，当有两个以上优势卵泡直径不小于18 mm时，停用药物并注射HCG，36～38 h后在B超引导下经患者配偶阴道取卵备用。

1.2.2 附睾穿刺取精 患者仰卧，利多卡因局部麻醉后，固定睾丸并用5 mL注射器抽取附睾精子。

1.2.3 精子冷冻 将精子保护液缓慢加入PESA精子中，按照1∶1比例充分混匀，封口后置于4 ℃冰箱降温30 min，再置于液氮盒上方熏蒸10 min，最后投入液氮罐中保存。

1.2.4 冻融附睾精子复苏 将精子冷冻管中的PESA精子取出置于温水烧杯内(35～37 ℃)20 min，按1:2比例加入培养液400×g离心5 min,留取沉淀置于37 ℃、5%CO2孵箱中平衡。

1.2.5 卵母细胞浆内单精子注射 在显微镜下选择活力和形态最佳精子，于7%PVP溶液中使用injiection针剧烈抽打精子颈部下方2/3处直至完全制动，将精子注射至MⅡ卵子内并回吸，当出现“跳水”动作后迅速将精子打入卵细胞内，并将受精卵置于培养箱中过夜。

1.2.6 优质胚胎判定 卵裂球数目≥6、大小规则、碎片≤20%定义为优质胚胎。

1.2.7 胚胎移植与妊娠判定 ICSI操作18～19 h后观察受精情况，以双原核(2PN)作为判断正常受精依据，并在25～26 h和42～44 h两次观察受精卵发育情况；受精后66～68 h后选择发育最优的胚胎进行移植，两周后抽血检测人绒毛膜促性腺激素水平，并于30 d左右后监测孕囊以排除生化妊娠，随访。

1.2.8 检测指标 受精率(受精卵子总数/ MⅡ卵子总数×100%)；正常受精率(正常受精数/总受精数×100%)；正常卵裂率(正常卵裂数/正常受精数×100%)；优质胚胎率(优质胚胎数/正常受精数×100%)；妊娠率(妊娠周期数/移植周期数×100%)；流产率(流产周期数/妊娠周期数×100%)。

2 结果

2.1 各组间临床资料对比 3组间年龄、子宫内膜厚度及成熟卵子获卵数均无显著差异(P>0.05，见表1)。

表1 3组间年龄、子宫内膜厚度及成熟卵获得数比较

组别女方年龄(岁)男方年龄(岁)子宫内膜厚度(mm)成熟卵获得数(个)新鲜PESA31.53±3.6633.57±4.548.22±2.669.31±3.77冷冻PESA32.98±4.3732.74±3.389.04±2.169.67±2.88新鲜射精32.71±4.1032.32±3.638.40±2.749.50±3.47P>0.05>0.05>0.05>0.05

2.2 3组间胚胎发育资料对比 各组间受精率、优质胚胎率等胚胎发育潜能情况均无显著差异(P>0.05，见表2)。

表2 3组间胚胎发育资料比较

组别总受精率(%)正常受精率(%)正常卵裂率(%)优质胚胎率(%)新鲜PESA90.25(583/646)94.67(552/583)93.29(515/552)39.49(218/552)冷冻PESA89.64(277/309)93.50(259/277)91.89(238/259)37.07(96/259)新鲜射精92.71(941/1015)95.54(899/941)94.78(852/899)43.49(391/899)P>0.05>0.05>0.05>0.05

2.3 3组间临床结局对比 3组间平均移植数、妊娠率和流产率无统计学差异(P>0.05，见表3)。

表3 3组间临床结局对比

组别移植胚胎数(个)妊娠率(%)流产率(%)新鲜PESA2.28±0.3342.42(28/66)10.71(3/28)冷冻PESA2.06±0.5237.84(14/37)7.14(1/14)新鲜射精2.15±0.3941.11(37/90)13.51(5/37)PP>0.05P>0.05P>0.05

3 讨论

PESA和ICSI技术解决了梗阻性无精子症的难题，但由于附睾内的精子数量少，且经常分散于附睾的各个位置，所以即使第一次PESA取精成功，下次仍有20%～30%的失败可能[3]，而女方从降调解月经周期到准备取卵是一个复杂过程，需要十余天甚至数十天的前期治疗，若女方取卵当天PESA取精失败，给患者夫妇造成的打击可想而知，因此，将上一周期或者用于诊断的剩余PESA精子冻融保存是十分有意义的。

从18世纪中叶，就曾有学者尝试将精子置于雪中进行保存[4]，但是长期以来，很多学者人为精子在冷冻过程中产生的冰晶会使得精子膜内压力升高，从而使精子细胞膜肿胀、破损甚至会产生应激反应而影响精子的受精功能，而且会损伤精子的染色体[5]，因此认为复苏后的精子不能取得满意的临床效果。但是也有学者认为只要附睾中能找到足够的存活精子，将其冷冻后再行ICSI操作是完全可行的[6]

而在我中心实际工作中发现，只要冷冻技术成熟、操作规范，复苏后绝大多数情况下都能找到足够的可用精子。本研究发现，复苏后的PESA精子无论其受精率、卵裂率和优质胚胎率与新鲜PESA精子及新鲜体外射精精子比较并无显著差异，而且妊娠率和流产率等临床结局也与新鲜精子相似，与Tsai等[7-10]研究结果一致。分析原因是：冷冻过程中虽然会对精子产生一些物理损伤，但同时也是一种优胜劣汰的筛选过程，只有那些受精能力强、活力好的精子能够存活下来，因此能够得到较好的临床结局。

综上所述，将PESA精子进行冻融保存是安全有效的。冻融PESA组表面看经济负担略微增加，但保障了取卵日有可用精子，避免了更多的经济损失。目前，我中心已经将PESA精子冷冻作为一种常规的辅助生殖技术进行全面应用。

[1] 刘艳丽，路芳鸣，孙丽君，等.精液参数和来源对ICSI助孕患者胚胎质量及临床结局的影响[J].重庆医科大学学报，2017,42(3):66-70.

[2] Peng Q P，Cao S F，Lyu Q F，et al．A novel method for cryopreservation of individual human spermatozoa[J].In Vitro Cell Dev BiolAnim，2011,47(8):565-572．

[3] 葛斌，杨智敏，刁英，等.无保护剂玻璃化冷冻技术在冻存PESA精子中的实用性研究[J].实用医学杂志,2016,32(1):91-93.

[4] Paoly D,Lombardo F,Lenzi A,et al.Sperm cryopreservation：effectes on chromationg structure [J]. Adv Exp Med Biol,2014,791(791):137-150.

[5] Said T M ，Gaglani A ，Agarwal A.Implication of apoptosis insperm cryo injury[J]．Repord Biomed Online,2010,21(4):456-462.

[6] Levron J ，Madgra I，Shefi S，et al.IVF outcome with cryopre served testicular sperm [J].Andrologia,2011,43(1):48-51.

[7] Lu Y U,Gao H J,Li B J,et al.Different sperm sourees and paramclers can influence intracytoplasmic sperm injection outcomes before sperm embryo implantain [J].J Zhejiang Univ Sei B,2012,13(1):1-10.

[8] Tsai C C,Huang F J,WangL J,et al.Clincal outcomes and dcvelopment of children born after intracytoplasnic sperm injection using extracted testicular sperm or ejaculated extreme severe oligo- astheno-teratozoospeospe rmia:a comparative study[J].Fertil Steril,2011,96(3):567-571.

[9] 0lddereid N B,Hanevik H I, Bakkevig I,et al.Prenanecy outcome according to male diagnosis after ICSI with non-ejaculated sperm compared with ejaculated controls[J]. Repord Biomed Oline,2014,29(4)417-423.

[10]Xie D,Qiu Z,Luo C,et al.Effect of spermatozoa from different sources on normal fertilization of oocytes and embryouquality and development in intracytoplasmic sperm injection eycles [J].South Med Univ,2014,34(6):857-861.

(编辑：王福军)

Application of freeze-thaw PESA sperm combined with ICSI in the treatment of obstructive azoospermia

Ge Bin,Yang Zhimin,Wang Lujuan,Yang Minghui

(Department of Reproductive Center,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo study the application of freeze-thaw PESA sperm combined with ICSI technology in treating obstructive anspermia.MethodsThe fresh PESA sperm,freeze-thaw PESA sperm,and fresh sperm were used to do the treatment with ICSI in the total 193 cycles. The results of fertilization,development and clinical outcome were analyzed retrospectively.ResultsAfter the treatment,the fertilization rates of the three groups were 94.67%,93.50%,and 95.54%,respectively. The normal cleavage rates were 93.29%,91.89%,and 94.78%. The quality embryo rates were 39.49%,37.07%,and 43.49%. The rates of pregnancy were 42.42%,37.84%,and 41.11%. And the abortion rates were 10.71%,7.14%,and 13.51%. In all of the above comparisons,there was no statistical difference among the three groups (P>0.05).ConclusionThe clinical effect of frozen and thawing PESA sperm can be similar to that of fresh sperm,which is safe and effective.

sperm frozen; percutaneous epididymal sperm aspiration; intracytoplasmic sperm injection

贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合LH字[2015]7449)。

R321.1

A

1000-2715(2017)04-0410-03

[收稿2017-06-08;修回2017-07-03]