HPLC法同时检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠及安赛蜜

袁 磊， 林 芳， 张 丽， 王一欣， 王 豆

(陕西省食品药品检验所， 陕西 西安 710065)

HPLC法同时检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠及安赛蜜

袁 磊， 林 芳， 张 丽， 王一欣， 王 豆

(陕西省食品药品检验所， 陕西 西安 710065)

建立高效液相色谱法同时检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的方法。样品经水提取、亚铁氰化钾与乙酸锌沉淀蛋白、氨水调pH值后离心处理，经Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱分离，甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液为流动相梯度洗脱，流速为0.7 mL/min，采用二极管阵列检测器检测，波长230 nm，光谱扫描范围为200～400 nm，采用保留时间与光谱进行双重定性。在14 min内苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜就能够达到较好的分离，在1～100 μg/mL呈良好的线性关系，线性相关系数大于0.999 8，检出限0.5～1 mg/kg,不同类别产品加标回收率在88.5%～98.4%之间，精密度<5%。结果表明，该方法适用范围广、灵敏度高、准确性好，适用于各种食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的检测。

苯甲酸； 山梨酸； 糖精钠； 安赛蜜； 高效液相色谱法

苯甲酸、山梨酸与糖精钠、安赛蜜是国际通用、高性价比的防腐剂与甜味剂，被广泛应用于食品中[1]。在食品生产中添加苯甲酸(钠)、山梨酸(钾)，能够起到防腐、延长食品保质期的作用；糖精钠、安赛蜜作为合成的甜味剂，是普通甜味剂甜味的500倍与130倍[2]，逐渐替代了传统的甜味剂而被应用在食品生产中。过多的食用防腐剂与甜味剂会对人体产生严重危害[3-6]，因此国家标准对防腐剂与甜味剂的使用范围与限量做了严格规定[7]，然而，这几种添加剂仍存在滥用现象，有生产者将低于限量标准的几种防腐剂与甜味剂混合使用以逃避监管。目前检测苯甲酸、山梨酸与糖精钠的方法有液相色谱法[8-9]、气相色谱法、液质联用法[10-12]，测定安赛蜜的方法有液相色谱法、液质联用法[13]、液相色谱- 蒸发光散射法[14]、离子色谱法[15]。国家标准方法有GB/T 23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法》、GB/T 5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》、GB/T 5009.140—2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》。这些检测方法覆盖的食品种类少、前处理方法较复杂，检测耗时长，不能同时测定多种甜味剂与防腐剂，而且只有饮料中安赛蜜的检测方法，无疑给日常的检测工作增加了难度与强度；因此，有必要建立一种同时检测多种防腐剂与甜味剂，并适用于多种食品类别的检测方法。

研究建立了一种同时测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的方法，该方法利用高效液相色谱系统- 梯度洗脱的方式，分离速率快、灵敏度高、适用于各种复杂基质样品的检测，优化了色谱条件，缩短了检测时间，抗干扰能力更强，方法的适用范围更广，同时二极管阵列检测器还可以对防腐剂与甜味剂进行光谱定性，使检测结果更加准确可靠。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜标准品，纯度均为99.9%，均购于Supelco公司;甲醇(色谱级)，Macron公司;乙酸铵(色谱级)，Duksan公司；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；样品为市售预包装食品。

1.2 仪器与设备

U3000型高效液相色谱仪(带二极管阵列检测器)，美国Thermo公司；UV- 2600型紫外分光光度计，日本岛津公司；PB- 10型酸度计，METTLER TOLEDO公司；LYNX4000型离心机，美国Thermo公司；HH- 1型水浴锅，北京科伟公司；KQ- 500DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1标准溶液的配制

苯甲酸、山梨酸储备液配制：精密称取苯甲酸、山梨酸适量，用碳酸氢钠溶液(20 g/L)溶解，用水定容，配置成1 mg/mL标准储备液。

糖精钠、安赛蜜储备液配制：精密称取糖精钠、安赛蜜适量，用水溶解定容，配置成1 mg/mL标准储备液。

1.3.2色谱和光谱条件

Agilent ZORBAX SB-Aq型色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，检测波长230 nm，流动相A为甲醇，流动相B为0.02 mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱，洗脱时间17 min;光谱扫描范围200～400 nm。

1.3.3样品处理

1.3.3.1 固体样品

样品称量前需捣碎混合均匀。

一般固体样品、保健食品、酱腌菜：称取5 g左右样品于具塞三角瓶中，加一定量的水，超声提取30 min,分别加入2 mL亚铁氰化钾溶液(106 g/L)与乙酸锌溶液(220 g/L)，混匀，全部移至容量瓶中用水定容，混匀，静置5 min后取部分上清液于离心管中，5 000 r/min离心5 min,上清液经0.45 μm滤膜过滤，供分析用[16-17]；酱腌菜需将离心上清液用水至少1倍稀释后经0.45 μm滤膜过滤，供分析用[18]。

蜜饯、水果干制品：称取5 g左右的样品于具塞三角瓶中，精密加入一定体积的水，超声震荡提取15 min，分别加入2.5 mL亚铁氰化钾溶液(106 g/L)与乙酸锌溶液(220 g/L)，混匀，以加入液体总体积为其定容体积，取部分溶液于离心管中，5 000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，供分析用[17-18]。

乳制品：称取2 g左右的样品于具塞三角瓶中，加10 mL的水使样品溶解，加入25 mL氢氧化钠溶液(0.1 mol/L)，混合后于70 ℃左右水浴锅中放置15 min,期间震摇1～2次，冷却后用硫酸溶液(0.5 mol/L)调pH值至近中性，分别加入2 mL亚铁氰化钾溶液(106 g/L)和乙酸锌溶液(220 g/L)，混匀，全部转移至容量瓶中用水定容，混匀，静置5 min后取部分上清液于离心管中，5 000 r/min离心5 min,经0.45 μm滤膜过滤，供分析用[19-21]。

1.3.3.2 半固体样品

含有胶基半固体样品：称取2 g左右的样品于具塞三角瓶中，加一定量的水，于70 ℃左右超声提取15 min,期间震摇1～2次，完全溶解后用氨水(体积比为1∶1)调pH值至近中性，分别加入2 mL亚铁氰化钾溶液(106 g/L)和乙酸锌溶液(220 g/L)，混匀，转移至容量瓶中用水定容，混匀，经0.45 μm滤膜过滤，供分析用[22]。

油脂、奶油类样品：前处理方法同乳制品。

1.3.3.3 液体样品

称取10 g左右的样品于具塞三角瓶中(如含有乙醇需水浴除去)，加一定量的水，用氨水(体积比为1∶1)调pH值至近中性，转移至容量瓶中用水定容，混匀，经0.45 μm滤膜过滤，供分析用[23]；碳酸饮料、茶饮料、液体调味品需将滤液用水至少1倍稀释后，供分析用[24-26]。

2 结果与分析

2.1 波长的选择

将1.3.1配制的4种储备液用水稀释至50μg/mL,于紫外分光光度计下进行波长扫描，扫描范围为200～400 nm。苯甲酸最大吸收波长为230～260 nm,山梨酸最大吸收波长为220～240 nm,糖精钠最大吸收波长为190～240 nm，安赛蜜的最大吸收波长为190～240 nm,见图1。综合扫描结果，波长230 nm能够使4种物质的响应值达到最大，因此选定波长为230 nm。

图1 苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜最大紫外吸收波长扫描图Fig.1 Maximum UV absorption wavelength scan of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame

2.2 流动相及流速的选择

为扩大方法的适用性，色谱柱选用常规反相C18柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm×5 μm)。根据文献，常用的流动相体系有甲醇- 乙酸铵溶液体系、甲醇- 磷酸二氢钾溶液体系、甲醇- 0.1%甲酸溶液体系。由实验得，使用甲醇- 磷酸二氢钾溶液体系4种物质出峰时间较慢，达30 min左右；甲醇- 0.1%甲酸溶液体系的流动相呈酸性，又因食品中加入的通常是苯甲酸钠、山梨酸钾，这些物质在酸性条件下可转化为苯甲酸、山梨酸，致使溶解度减弱，影响检测，因此采用甲醇- 乙酸铵溶液体系。

用0.02 mol/L乙酸铵作流动相，设定流速为1.0 mL/min,实验发现山梨酸与糖精钠无法分离。将甲醇与0.02 mol/L乙酸铵按体积比10∶90配成流动相，实验发现山梨酸与糖精钠能够分离，但苯甲酸与安赛蜜无法达到基线分离；因此采用梯度洗脱的方法分离。经实验，利用洗脱方法能够使4个组分完全分离，梯度洗脱条件见表1。用1.0 mL/min流速洗脱时，由于苯甲酸出峰较快，溶剂峰对其有干扰；流速调整到0.7 mL/min时延长了苯甲酸的出峰时间，能够得到好的分离效果，见图2。

表1 梯度洗脱条件

流动相A为色谱甲醇，流动相B为0.02 mol/L乙酸铵溶液。

图2 4种混合标准溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed 4 kinds of standard solution

2.3 线性关系与检出限分析

将苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜4种标准储备液稀释成1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/mL混合标准溶液，用前述色谱条件进样，以对应色谱图的峰面积为纵坐标(Y),以质量浓度(X, μg/mL)为横坐标做线性回归。结果表明，4种物质在1～100 μg/mL范围内呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999 8，说明该方法适用于苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的定量分析。在实验条件下，以对应色谱峰响应值10倍信噪比的质量浓度为定量限的进样浓度，按取样量为5 g,定容体积为50 mL,进样量为10 μL，计算得方法的检出限为0.5～1 mg/kg，与国标方法比较，检出低于国家标准方法(见表2)。

表2 苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的线性回归方程、相关系数、检出限与国标检出限

名称回归方程相关系数(r)检出限/(mg·kg-1)国标检出限/(mg·kg-1)苯甲酸Y=065510X+056711099990518山梨酸Y=145465X+013637099990512糖精钠Y=057917X+020869099991030安赛蜜Y=076513X+006371099980540

2.4 回收率与精密度的分析

根据食品的分类与基质的不同，选取了不含有苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的配制酒、饮料、乳制品、焙烤食品(饼干)、酱腌菜、果酱、蜜饯、肉制品为样品，加入3个不同浓度的标准品，使用2.3.3处理方法，每个添加水平平行做5份，每个样品重复测定2次，计算不同样品不同添加水平平均加标回收率与精密度，结果见表3。由表3可以看出，不同样品的加标回收率在88.5%～98.4%，精密度<5%，回收率与精密度都在可接受范围内。加标量越大，回收率越高，精密度越好。

表3 不同样品加标回收率与精密度检测结果

2.5 不同食品检测与光谱确证分析

使用上述方法对9种食品进行了实际检测，结果见表4，并对检出的样品进行3D光谱比较，见图3，结果显示在各成分的保留时间处均未有干扰，说明本方法的使用范围广，特异性与抗干扰能力都很强，部分样品的色谱图与光谱图见图4～图8。

图3 苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜紫外吸收光谱图Fig.3 UV absorption spectrum of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame

3 结 论

研究建立了高效液相色谱法同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的方法，该方法与国标比较减少了一个检测体系，增加了方法的适用范围，且回收率与稳定性较好，检测准确，能够满足对食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠与安赛蜜的检测要求和实际检测工作需要，也为进一步的方法开发提供了重要依据。在实验中发现样品的pH值对检测结果影响较大，过酸或过碱的样品会造成目标物峰飘移，使得无法定性，因此尽可能将样品pH值调至近中性，消除了峰飘移的问题，也可使得苯甲酸、山梨酸以盐的形式存在，增加提取效率，使检测更加准确。

表4 不同食品中添加剂检测结果

N.D.表示未检出。

图4 果酱样品检测结果色谱图Fig.4 Chromatogram of jams sample test results

图5 果酱样品中山梨酸光谱图Fig.5 UV absorption spectrum of sorbic acid in jam samples

图6 配制酒样品检测结果色谱图Fig.6 Chromatogram of liquor sample test results

图7 配制酒中苯甲酸、山梨酸、糖精钠紫外光谱图Fig.7 UV absorption spectrum of benzoic acid, sorbic acid, and saccharin sodium in liquor samples

图8 饼干中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜加标色谱Fig.8 Chromatogram of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame in biscuits

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(责任编辑：张逸群)

SimultaneousDeterminationofBenzoicAcid,SorbicAcid,SaccharinSodiumandAcesulfameinFoodbyHPLC

YUAN Lei, LIN Fang, ZHANG Li, WANG Yixin, WANG Dou

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl，Xi’an710065,China)

In this study, a method for simultaneous determination of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium and acesulfame in food by HPLC was established. The samples were extracted by water, precipitated protein by potassium ferrocyanide and zinc acetate, adjusted pH with ammonia water and centrifuged. Agilent ZORBAX SB-Aq column was applied with mobile phase consisting of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate solution by gradient elution with a flow rate of 0.7 mL/min. Targets were detected by diode array detector detection with detection wavelength of 230 nm and a double qualitative determination of retention time and spectra was performed. The spectral scanning range was 200～400 nm. Benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame K could be effectively separated within 14 min. A good linear relationship was obtained in the range of 1-100 μg/mL. The linear correlation coefficient was greater than 0.999 8. The average recoveries ranged from 88.5% to 98.4% and the precision less than 5%. The detection limits ranged from 1 mg/kg to 2 mg/kg. The method has wide application range, high sensitivity, and good accuracy, and is suitable for the detection of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame in various foods.

benzoic acid; sorbic acid; saccharin sodium; acesulfame; HPLC

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.010

2095-6002(2017)04-0072-08

袁磊，林芳，张丽，等. HPLC法同时检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠及安赛蜜[J]. 食品科学技术学报，2017,35(4):72-79. YUAN Lei, LIN Fang, ZHANG Li, et al. Simultaneous determination of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium and acesulfame in food by HPLC[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):72-79.

2016-12-02

陕西省食品药品快速检测公共服务平台建设项目(2014FWPT- 01)。

袁 磊，男，本科，主要从事食品安全性检测与快速检测方法的研究。

TS207.3; O657.72

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