脂肪酶在催化酯交换过程中的稳定性

李成,王胜杰,季敏,黄清吉,黄仕群,翁新楚

(1.上海大学环境与化学工程学院,上海200444;2.上海大学生命科学学院,上海200444; 3.大马棕榈油技术研发(上海)有限公司,上海201108)

脂肪酶在催化酯交换过程中的稳定性

李成1,王胜杰2,季敏3,黄清吉3,黄仕群3,翁新楚2

(1.上海大学环境与化学工程学院,上海200444;2.上海大学生命科学学院,上海200444; 3.大马棕榈油技术研发(上海)有限公司,上海201108)

脂肪酶是一种能够在非水相体系中催化酯交换的生物酶.在实际应用过程中,脂肪酶的稳定性非常重要,因为这会直接影响工业化的成本和效率.针对温度、时间、溶剂和酰基供体对脂肪酶催化酯交换反应稳定性的影响进行了系统的研究.结果表明,温度和溶剂极性对脂肪酶催化稳定性的影响比较显著,而时间和酰基供体的影响不明显.

脂肪酶;酯交换;稳定性

脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)是一种既能在水相中水解长链酯类化合物,又能在非水相中催化酯类合成反应或者酯交换反应的酶类[1].它是一种重要的工业酶类,常用于油脂水解、食品风味和香味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性,以及添加于洗涤剂和化妆品中等[2-3].特别是在油脂化工和有机合成工业中,酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点,尤其是1,3-专一脂肪酶可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分,具有巨大的应用潜力[4-6].

在酶法制备类可可脂的研究中,脂肪酶一直是各国科研工作者研究的热点[7-10].本工作主要研究了脂肪酶在催化酯交换反应制备类可可脂过程中的稳定性,系统地分析了温度、时间、溶剂、酰基供体等对脂肪酶稳定性的影响.

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

棕榈油中间分提物、硬脂酸,由大马棕榈油技术研发(上海)有限公司赠送.脂肪酶LipozymeTLIM,购自诺维信(中国)有限公司.正己烷、丙酮、乙醚等均为分析纯,购自中国医药集团上海化学试剂有限公司.

1.2 实验仪器

TECHCOMP7890F气相色谱仪(上海天美科学仪器公司),BSA224S-CW电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司),DK-S12电热恒温水浴锅(上海华连医疗器械有限公司), RE-85Z旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂),MYP11-2恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪表制造有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 脂肪酶酯交换活力

在一定条件下每分钟交换1µmol硬脂酸需要的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U).

称取4.0 g橄榄油和4.0 g硬脂酸于100mL三颈烧瓶中.加入10.0mL正己烷,置于恒温磁力搅拌器上,温度为55◦C,转速为300 r/min.待温度稳定后加入1.0 g脂肪酶,并开始计时.5 min后趁热过滤去除脂肪酶以终止反应.分离提纯甘油三酯,利用气相色谱检测酯交换进入橄榄油中的硬脂酸含量.

脂肪酶酯交换活力计算公式为

式中:X为脂肪酶酯交换活力,U/g;M为橄榄油脂肪酸摩尔量,µmol;ΔST为酯交换的硬脂酸占总脂肪酸的比例,%;m为脂肪酶的质量,g;T为反应时间,min.

1.3.2 温度对脂肪酶稳定性的影响

称取4.0 g棕榈油中间分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三颈烧瓶中.加入10.0 mL正己烷和1.0 g脂肪酶,分别在45,50,55,60,65和70◦C下连续反应60 h后,过滤出酶.用正己烷冲洗干净,检测脂肪酶酯交换活力.

1.3.3 时间对脂肪酶稳定性的影响

称取4.0 g棕榈油中间分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三颈烧瓶中.加入10.0 mL正己烷和1.0 g脂肪酶,在55◦C下分别反应4,8,12,24,36,48和60 h后,过滤出酶.用正己烷冲洗干净,检测脂肪酶酯交换活力.

1.3.4 溶剂对脂肪酶稳定性的影响

称取4.0 g棕榈油中间分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三颈烧瓶中.加入1.0 g脂肪酶,分别加入10.0 mL正己烷、石油醚、甲苯和丙酮,在55◦C条件下反应60 h后,过滤出酶.用正己烷冲洗干净,检测脂肪酶酯交换活力.

1.3.5 酰基供体对脂肪酶稳定性的影响

称取4.0 g棕榈油中间分提物.分别称取4.0 g酰基供体(硬脂酸、硬脂酸甲酯)于100mL三颈烧瓶中.加入1.0 g脂肪酶,10.0mL正己烷在55◦C条件下反应60 h后,过滤出酶.用正己烷冲洗干净,检测脂肪酶酯交换活力.

2 实验结果与讨论

2.1 温度对脂肪酶稳定性的影响

图1表示脂肪酶在不同反应温度下,连续催化棕榈油中间分提物与硬脂酯交换反应60 h后,相对酯交换活力的变化情况.可以看出,当反应温度不高于55◦C时,脂肪酶在连续催化60 h后相对酯交换活力变化不是很明显,说明酶活力的损失很小,相对酯交换活力达到97.3%.但是当反应温度高于55◦C时,脂肪酶的相对酯交换活力就出现明显的下降趋势.当反应温度达到70◦C时,60 h后脂肪酶的相对酯交换活力只有67.9%,说明脂肪酶的酯交换活力已经出现较大程度的下降.可见,温度对脂肪酶催化酯交换反应的稳定性具有较大影响.在实际应用中,应该尽量使用较低的反应温度,这样既可以避免脂肪酶的失活,也可以降低能耗,节约成本.

图1 脂肪酶在不同反应温度下连续催化酯交换反应60 h后的相对酯交换活力Fig.1 Relative interesterification activities of lipase at diff erent reaction temperatures for 60 h after catalytic interesterifi cation reactions

2.2 反应时间对脂肪酶稳定性的影响

脂肪酶催化酯交换稳定性最重要的指标就是能够在一定反应温度条件下,经过长时间的连续酯交换反应而酯交换活力损失较小,这对实际生产应用具有极其重要的意义.本工作通过分析在不同反应温度下反应时间对脂肪酶酯交换活力的影响来判断脂肪酶的稳定性.由图2可以看出,脂肪酶在相对较低的温度条件下,催化酯交换反应的稳定性明显优于较高的反应温度条件,脂肪酶在低于60◦C的酯交换反应温度下的稳定性显著优于60◦C以上.在55◦C反应温度下经过连续反应60 h后,相对活力仅下降2.7%,而在70◦C反应温度下,相对活力下降的速率明显加快,达到了32.1%.反应时间对脂肪酶有一定的影响,当催化体系的温度保持相对较低的时候,脂肪酶的酯交换活力损失较少.随着催化体系温度的升高,脂肪酶的酯交换活力损失开始快速减少.因此,在实际生产中要控制好整个反应体系的温度,以防温度过高使脂肪酶失活.

2.3 溶剂对脂肪酶稳定性的影响

本工作选取常用的几种不同极性的有机溶剂作为脂肪酶催化酯交换反应的有机相溶剂.从图3可以看出,溶剂极性越小,脂肪酶的稳定性就越高.在弱极性溶剂正己烷和石油醚反应体系中,脂肪酶连续催化酯交换反应60 h后的相对活力依然保持在97%以上,说明脂肪酶在弱极性溶剂中的稳定更高.这可能是由于在弱极性溶剂中,脂肪酶的三维结构比较稳定,不易出现失活.在极性溶剂丙酮中脂肪酶的相对酯交换活力下降速率明显高于弱极性溶剂,经过0 h连续反应后的相对酯交换活力降至56.9%.这可能是由于极性溶剂中的质子会影响脂肪酶酶活中心的氢键,从而导致脂肪酶的酯交换活力下降.

图2 脂肪酶在不同反应温度下连续催化酯交换反应的相对酯交换活力随时间的变化Fig.2 Changes of the relative interesterification activities of lipase at diff erent reaction temperatureswith diff erent time in the caltalytic interesterification reactions

图3 脂肪酶在4种不同溶剂系统中反应温度为55◦C下连续催化60 h后的相对酯交换活力Fig.3 Relative interesterification activities of lipase in 4 diff erent solvent systems after catalytic 60 h of continuous catalytic reaction under 55◦C

2.4 酰基供体对脂肪酶稳定性的影响

本工作比较了硬脂酸和硬脂酸甲酯两种酰基供体对脂肪酶催化酯交换反应过程中的稳定性的影响,结果如图4所示.分析发现,酰基供体对脂肪酶催化稳定性的影响不明显.进一步研究发现,虽然两种不同酰基供体对脂肪酶催化稳定性没有明显影响,但是酰基供体硬脂酸甲酯的酯交换反应速率明显高于硬脂酸.在实际应用中可以根据不同的需求选择合适的酰基供体.

3 结束语

脂肪酶是催化酯交换反应中最重要的酶,因其具有立体专一性已被广泛应用于食品、化工等领域.在实际生产应用中如何保持脂肪酶的稳定性是脂肪酶工程研究的重点.本工作针对温度、时间、溶剂和酰基供体对脂肪酶催化酯交换反应过程中稳定性影响的研究,希望可以为脂肪酶的实际应用提供参考.研究发现,温度和溶剂的极性对脂肪酶催化酯交换反应的稳定性影响最为显著,其在相对低温和弱极性溶剂中的稳定性最优,而高温和极性溶剂对其稳定性影响显著.因此,在实际生产应用过程中,应该尽量避免使用极性溶剂作为反应溶剂.酰基供体对脂肪酶催化稳定性的影响不明显,但是不同的酰基供体对脂肪酶的酯交换反应速率有较大影响,以硬脂酸甲酯作为酰基供体的催化速率明显高于以硬脂酸作为酰基供体.

图4 脂肪酶在不同酰基供体下连续催化酯交换反应60 h后的相对酯交换活力Fig.4 Relative interesterifi cation activities of lipase after 60 h of continuous catalytic reaction in diff erent acyl donors

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Stab ility o f lipase in the process o f cataly tic in teresterifi cation reaction

LICheng1,WANG Shengjie2,JIMin3,OOIChengkeat3,WONG Sookhan3, WENG Xinchu2
(1.School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 2.School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 3.PalmO il Research and Technical Service Institu te of MPOB,Shanghai 201108,China)

Lipase is a kind of enzyme that can catalyze interesterifi cation in a non-aqueous system.Stability of lipase is important in practical applications because of its eff ection of the production cost and effi ciency.To understand the influence of diff erent factors on catalytic stability of lipase,the eff ects of temperature,time,solvents and acyl donor on stability of lipase interesterifi cation are studied.The resu lts show that the eff ects of temperature and solvent polarity on catalytic stability of lipase are significant.But the eff ects of time and acy l donor are not obvious.

lipase;interesterification;stability

TS 201

A

1007-2861(2017)04-0623-05

DO I:10.12066/j.issn.1007-2861.1692

2015-09-08

翁新楚(1962—),男,教授,博士生导师,研究方向为油脂化学.E-mail:wxch@staff.shu.edu.cn