非典型性脂肪瘤性肿瘤/高分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表达和基因扩增检测及临床意义

潘丹玲，陈小岩，陈灵锋，林 瀛

非典型性脂肪瘤性肿瘤/高分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表达和基因扩增检测及临床意义

潘丹玲，陈小岩，陈灵锋，林 瀛

目的探讨非典型性脂肪瘤性肿瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma, ALT/WDL)中MDM2蛋白表达和基因扩增，分析MDM2蛋白表达和基因扩增在ALT/WDL中的意义。方法采用免疫组化EliVision两步法及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测58例ALT/WDL中MDM2蛋白表达及基因扩增状态。结果免疫组化检测显示58例ALT/WDL中MDM2蛋白阳性率为79.3%；FISH法检测MDM2基因扩增率为96.5%。免疫组化和FISH检测结果阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。结论MDM2蛋白表达和MDM2基因扩增为ALT/WDL的诊断提供依据；由于免疫组化检测阳性率接近80%，故在多数没有FISH条件的单位予以开展免疫组化MDM2蛋白检测，可以帮助诊断大多数ALT/WDL病例。

非典型性脂肪瘤性肿瘤/高分化脂肪肉瘤；MDM2；免疫组织化学；荧光原位杂交

非典型性脂肪瘤性肿瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma, ALT/WDL)是脂肪肉瘤中最常见类型，占脂肪肉瘤的40%～45%，好发于中老年人，发病年龄高峰为50～70岁，以男性多见，发生于腹膜后者以女性略多见[1]。ALT/WDL可发生于四肢皮下或深部软组织，临床上无特殊的症状和体征，起病多隐匿，缓慢性生长。ALT/WDL最重要的形态学依据脂肪母细胞诊断，但有时也难以查见典型的脂肪母细胞，因为脂肪母细胞也可出现在某些良性脂肪源性肿瘤内，因此ALT/WDL较难诊断。随着影像学(如B超检查)的发展，在B超引导下穿刺活检的组织量少也极大地增加ALT/WDL诊断难度。本文现采用免疫组化EliVision两步法检测MDM2蛋白表达，应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术检测MDM2基因扩增状态，探讨两者在ALT/WDL病理诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1临床资料收集福建省立医院2010年1月～2015年12月手术或穿刺活检的ALT/WDL组织标本58例，均经病理学明确诊断为ALT/WDL。其中脂肪瘤样脂肪肉瘤35例，硬化性脂肪肉瘤18例，炎症性脂肪肉瘤3例，梭形细胞性脂肪肉瘤2例；年龄39～82岁，平均(50±10)岁；肿物直径4.2～20 cm；女性26例，男性32例。

1.2方法

1.2.1免疫组化 肿瘤标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片脱蜡，HE染色，免疫组化采用EliVision两步法染色。MDM2抗体克隆号为SPM14，购自福州迈新公司。

1.2.2FISH法 标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，脱蜡，切片预处理，蛋白酶消化，固定，DNA变性，杂交，DAPI复染，信号计数。ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12双色探针试剂盒，购自德国ZytoVision GmbH公司。

1.3结果判断

1.3.1免疫组化判断 MDM2表达主要定位于细胞核，阳性肿瘤细胞核呈粗细不等、深浅不一的棕黄色颗粒即判为阳性。

1.3.2FISH判断 随机计数至少20个肿瘤细胞核中的双色信号，根据MDM2试剂盒说明书判读结果。细胞核内存在多个绿色信号或簇状绿色信号提示MDM2基因扩增，本组56例MDM2高度扩增；正常细胞的间期细胞核为2个绿色和2个红色信号，提示MDM2基因无扩增。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。采用连续校正χ2检验或Fisher精确概率法分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1组织学特征ALT/WDL从组织形态学可分为4种主要亚型：脂肪细胞性(脂肪瘤样)、硬化性、炎症性、梭形细胞性，且可以多种亚型并存。镜下主要由相对成熟的增生脂肪组织构成，与良性脂肪源性肿瘤相比，细胞大小差异有显著性(核局灶异型性、核深染)，可见数量不等的单泡或多泡脂肪母细胞。

2.2MDM2蛋白表达及基因扩增58例ALT/WDL中，MDM2蛋白阳性者46例，阳性率为79.3%(图1)；56例MDM2基因扩增，扩增率为96.5%(图2)。FISH检测：46例MDM2蛋白阳性者MDM2基因均扩增；12例MDM2蛋白阴性者10例MDM2基因扩增，两者相比差异有统计学意义(χ2=7.940，P=0.005，表1)。

表1 ALT/WDL中MDM2蛋白表达及基因扩增[n(%)]

①②A②B图1 MDM2的表达,EliVi-sion两步法图2 A.MDM2基因扩增;B.MDM2基因无扩增

3 讨论

WHO(2013)软组织肿瘤分类及诊断标准系列将ALT/WDL确定为中间性肿瘤，ALT ICD-O编码为8850/1，高分化脂肪肉瘤ICD-O编码为8850/3。ALT/WDL定义为具有局部侵袭性的中间恶性间叶性肿瘤，肿瘤全部或部分由成熟脂肪组织构成，细胞大小差异有显著性，且脂肪细胞和间质细胞的细胞核至少有局灶异型性。其中散在的深染核常为多核的间质细胞以及数量不等的单泡或多泡脂肪母细胞(存在单个或多个界限清楚的胞质内空泡，扇贝形分布于增大的深染核周围)有助于诊断。病理学诊断主要依赖常规染色切片技术，经光镜观察细胞异型性和结构异常表现对ALT/WDL进行诊断。普遍认为脂肪母细胞是所有类型脂肪肉瘤的特征，但是应注意仅有脂肪母细胞不能诊断ALT/WDL，并非所有的ALT/WDL均有脂肪母细胞。ALT/WDL发生于深部者具有多次复发的可能，并可发生去分化和转移。

ALT/WDL易与一些良性脂肪源性肿瘤混淆，尤其在穿刺活检标本中，ALT/WDL的诊断难度增大。根据显微镜下肿瘤组织结构及细胞组成不同，ALT/WDL分为脂肪瘤样脂肪肉瘤、硬化性脂肪肉瘤、炎症性脂肪肉瘤、梭形细胞脂肪肉瘤4种亚型。在日常工作中，ALT/WDL需与以下疾病鉴别。(1)梭形细胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤：其是同一组肿瘤的两极表现，属于少见特殊类型的良性脂肪性肿瘤，部分病例可单纯为梭形细胞或多形细胞组成，大多数病例同时存在两种形态学特征，有时与梭形细胞脂肪肉瘤较难鉴别。梭形细胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤常位于颈、背部皮下组织，为无痛性结节，由不同数量的梭形细胞、核深染圆形细胞和多核巨细胞组成，梭形瘤细胞无明显异型性，与脂肪细胞相互穿插，间质可见较粗胶原纤维束。ALT/WDL常位于肢体或腹膜后深部软组织，镜下可见核深染的异型间质细胞，肿瘤组织内缺乏粗大胶原纤维结构。梭形细胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤免疫组化标记CD34呈阳性，MDM2呈阴性，MDM2基因无扩增，与ALT/WDL可资鉴别。(2)脂肪坏死及脂肪肉芽肿：有时与ALT/WDL难以鉴别，但脂肪坏死及脂肪肉芽肿镜下见吞噬脂质的泡沫组织细胞，常伴多核巨细胞和炎症细胞，无异型的脂肪母细胞，且MDM2蛋白不表达，MDM2基因无扩增，均可与ALT/WDL鉴别。(3)脂肪瘤病需与脂肪瘤样脂肪肉瘤：脂肪瘤病可累及身体的不同部位，镜下见脂肪组织弥漫性过度增生，主要是由成熟的脂肪细胞构成，脂肪细胞大小形态一致，无明显异型细胞；脂肪瘤样脂肪肉瘤常见于中老年人，肿瘤内可见核深染的异型脂肪母细胞，且MDM2蛋白表达、MDM2基因扩增，两者可资鉴别。(4)其他肿瘤：硬化性脂肪肉瘤间质大量胶原性纤维，胶原纤维可伴玻璃样变及钙化，脂肪母细胞虽可见，但一般数量较少，故常与上述梭形细胞肿瘤难以鉴别，但是硬化性脂肪肉瘤镜下可见核深染且异型的间质细胞散在分布于胶原纤维及脂肪细胞中，上述梭形细胞肿瘤组织均无脂肪细胞成分，MDM2蛋白一般不表达，虽偶可表达，但MDM2基因无扩增可资鉴别。

ALT/WDL的诊断与鉴别诊断需依赖于MDM2蛋白与MDM2基因检测，由此可见免疫组化EliVision两步法检测MDM2蛋白表达与FISH法检测MDM2基因扩增对ALT/WDL病理学诊断有重要意义。MDM2基因最初发现于小鼠的第10号染色体C1～C3 区，是从1个含有双微体的自发转化的BALB/3T3DM细胞中克隆出来的高度扩增基因，在自发转化成纤维细胞中被发现。该自发转化的每个细胞含有25～30双微体，其经重组转染后引起基因扩增。有文献报道人MDM2基因位于染色体12q13-14区段，MDM2在细胞由G1期向S期过渡中起调控细胞周期进程的作用，其被认为能控制正常细胞的分化和增殖[2-3]，其编码的蛋白质可以与p53蛋白结合，负性调节p53蛋白引起肿瘤发生[4]。ALT/WDL细胞遗传学特征是显示超额环状染色体和巨染色体，其中含有扩增的12q13-15序列，这一区域最恒定的扩增是MDM2基因[5-7]。

本组ALT/WDL中MDM2蛋白阳性率为79.3%，MDM2基因扩增率为96.5%，与国外文献[8-12]报道一致，提示免疫组化检测MDM2蛋白及FISH技术检测MDM2基因是ALT/WDL有效的辅助诊断手段。Binh等[9]也同时发现部分恶性间叶性肿瘤，如恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、黏液性脂肪肉瘤等，MDM2蛋白也可表达，但这些恶性间叶源性肿瘤并不存在MDM2基因扩增。提示作为ALT/WDL诊断的辅助手段，MDM2蛋白敏感性好但特异性差，对于某些难以诊断的ALT/WDL，如果MDM2的免疫组化不足以支持诊断，或者免疫组化结果与其他临床病理特征不符时，可使用FISH技术检测进一步确诊。值得注意的是，待检组织中肿瘤成分的多少及标本处理等均会影响检测结果；同时石蜡组织保存时间越久，提取DNA的效果越不理想。本组有2例MDM2基因无扩增均为穿刺活检小标本，分析原因可能是真阴性，也可能是技术或标本质量原因造成的假阴性，或者是穿刺活检小标本镜下肿瘤组织极少，因肿瘤的异质性造成的假阴性。

本实验ALT/WDL中MDM2蛋白阳性率为79.3%，MDM2基因扩增率为96.5%；MDM2基因阳性组明显高于MDM2阴性组(P<0.01)，差异具有统计学意义，提示MDM2蛋白的表达和基因扩增为ALT/WDL的诊断提供依据，MDM2基因扩增作为独特的分子标志物在ALT/WDL的诊断中具有较高的敏感性和特异性。由于本组免疫组化EliVision两步法检测MDM2蛋白阳性率高，故在大多数无FISH条件的医院行免疫组化标记MDM2蛋白的检测，可以帮助诊断大多数ALT/WDL患者。

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ClinicalsignificanceofMDM2proteinexpressionandgeneamplificationinatypicallipomatoustumour/well-differentiatedliposarcoma

PAN Dan-ling, CHEN Xiao-yan, CHEN Ling-feng, LIN Ying

(DepartmentofPathology,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

PurposeThis study was to investigate the clinical significance of MDM2 protein expression and gene amplification in atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma (ALT/WDL).MethodsMDM2 protein expression and gene amplification were detected by immunohistochemistry of EliVision two-step method and fluorescence in situ hybridization (FISH) in 58 cases of ALT/WDL.ResultsImmunohistochemical staining showed that the positive rate of MDM2 was 79.3%, MDM2 gene amplification rate by FISH assay was 96.5%. There was statistically significant differences between immunohistochemistry and FISH (P<0.05).ConclusionMDM2 protein expression and MDM2 gene amplification provide the basis for diagnosis of ALT/WDL. However, a positive rate of MDM2 by immunohistochemistry is nearly 80%, so we recommand to carry out immunohistochemical MDM2 protein detection in most conditions without FISH which can help in the diagnosis of most cases of ALT/WDL.

atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma； MDM2； immunohistochemistry； fluorescence in situ hybridization

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.012.html

福建医科大学省立临床医学院福建省立医院病理科，福州 350001

潘丹玲，女，副主任医师。E-mail： pandanling0909@sina.com 陈小岩，女，教授，主任医师，通讯作者。E-mail： fjslyyblk@sina.com

R 738.6

:A

:1001-7399(2017)07-0759-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.012

接受日期：2017-05-17