海捕虾肉蛋白的糖基化改性工艺研究

郑 炜，谢 超

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

海捕虾肉蛋白的糖基化改性工艺研究

郑 炜，谢 超

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

海捕虾主要包括红虾、脊腹褐虾等，其体型较小，肉质鲜美，具有极高的营养价值和巨大的经济开发价值，对人体的保健作用，特别是小儿、孕妇和老人均有补益功效。本研究以海捕虾为原料，利用现代食品加工技术对海捕虾进行糖基化处理和嫩化处理，研究得出海捕虾肉蛋白进行糖基化改性实验，其最优条件为：羧甲基纤维素钠添加量为8 μg/m L，反应时间20 min，反应温度60℃，pH为8.4。通过木瓜蛋白酶和复合磷酸盐对海捕虾仁嫩化试验验证，得出最佳组合海捕虾肉蛋白嫩化处理后虾肉的剪切力比处理前降低了20.45%。通过实验对海捕虾即食食品的加工工艺贮藏工艺进行了改良和优化，开发了具有独特风味的调味方便食品。

海捕虾；蛋白；糖基化；嫩化；方便食品

虾类捕捞是浙江省重要的渔业作业方式，舟山沿岸海域作为浙江重要渔场之一，在经济发展下迸发的海捕虾总产量及虾产品贸易需求量，为虾类食品的迅猛发展提供了优质的市场氛围[1]。但由于深度加工处理技术的匮乏，很大程度上依赖初步加工的现状，使深化海捕虾加工技术问题迫在眉睫[2]。现在市场上所销售的虾仁制品，很大程度上还是依赖传统的加工模式下出来的产品；冷冻虾仁无论是前期速冻还是运输恒温，资金投入比重占比较大，企业利润不明显；另外虾类制品呈现出的高度相似性，和购买后需二次加工，与消费者开袋即食的要求相距甚远[3]。本研究利用海捕虾的特性，融入新型食品加工技术，对已有的海捕虾即食食品制作和贮藏工艺流程进行优化和改良，以开发出一种风味独特的休闲食品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料：新鲜海捕虾购于舟山农贸场；食品级六偏磷酸钠、三聚磷酸钠，食品级磷酸氢二钠；木瓜蛋白酶；牛血清白蛋白，盐酸，无水乙醇，羧甲基纤维素钠，壳聚糖，考马斯亮蓝G-25等，以上试剂均为分析纯。

实验仪器：真空包装机，高精度电子计数台秤，高速均质机，高压蒸汽灭菌锅。

1.2 虾肉蛋白糖基化试验

糖基化可以优化蛋白质的功能和结构，比如合理依据糖基化反应对蛋白质折叠和卷曲稍加修饰[4]，因而对蛋白质主要就有下列四个方面的影响：第一、糖基化可以加强稳定蛋白质的结构[5]。第二、糖基化反应可以对蛋白质分子的生物活性产生一定的改变，第三、提高糖基化与蛋白质的溶解性[6]。第四、糖基化能降低蛋白质的免疫活性[7]。

在本实验中，将新鲜海捕虾去除外壳、去掉头并清洗干净。虾肉绞碎后，与50 mmol/L Na Cl溶液按1:9比例混合均匀，用HCl溶液调节pH值至2.39，用均质机均质5 min；然后将均质液置于4 500 r/min离心15 min，去除沉淀后，调节上清液的p H值为5.4[8]。重复上述步骤3次后收集最终沉淀，最后将获得的蛋白进行冷冻干燥。

1.2.1 糖类对海捕虾蛋白改性效果

选择反应糖类分别为羧甲基纤维素钠、壳聚糖、葡萄糖、葡萄糖和乳糖，蛋白浓度为2 mg/mL，糖用量4 mg/mL，55℃、pH8.4下反应20 min，再测定制备的糖基化蛋白的糖基化程度及其溶解性。

1.2.2 糖用量对海捕虾蛋白改性的影响

分别称取0、2、4、6、8 mg/mL羧甲基纤维素钠，控制虾肉蛋白浓度为2 mg/mL，55℃、pH8.4条件下反应20 min，再测定制备的糖基化蛋白的糖基化程度及其溶解性。

1.2.3 pH值对海捕虾蛋白改性影响

设定 p H=8.1，p H=8.2，p H=8.3，p H=8.4，p H=8.5 条件，蛋白浓度 2 mg/m L，添加羧甲基纤维素钠量为4 mg/mL，在55℃下反应20 min，再测定制备的糖基化蛋白的糖基化程度及其溶解性。

1.2.4 反应时间对海捕虾蛋白改性影响

反应时间设定10、15、20、25、30 min，蛋白浓度为2 mg/m L，添加羧甲基纤维素钠量为4 mg/mL，在55℃，pH=8.4条件下反应，再测定制备的糖基化蛋白的糖基化程度及其溶解性。

1.2.5 反应温度对海捕虾蛋白改性影响

反应温度设定45、55、65、75、85℃，蛋白浓度为2 mg/mL，添加羧甲基纤维素钠量为4 mg/mL，pH=8.4条件下反应15 min，再测定制备的糖基化蛋白的糖基化程度及其溶解性。

1.2.6 正交试验优化虾仁蛋白糖基化条件

以制备的糖基化蛋白的糖基化程度及其溶解性为依据，通过单因素试验确定各因素水平取值范围，以L9（43）正交表制定试验方案，优化糖基化条件。

1.3 海捕虾肉蛋白嫩化试验

把食用中破坏肌肉结构所需的力量大小用嫩度来衡量，它可以直观的反映出产品的质构性，并对后期加工形成的肉制品的咀嚼与营养等产生作用[9]，直接影响到肉制品的口感、营养、消化和风味等。判定肉品成熟嫩化的着重点在于肌原纤维结构与相关蛋白的降解程度[10]。新鲜水产品水分含量高，嫩度好，但其组织会随时间失水导致嫩度降低。

1.3.1 木瓜蛋白酶对海捕虾仁影响

分别配制0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%浓度木瓜蛋白酶溶液。控制反应时间6 min，反应温度10℃。测定其条件下的失水率跟剪切力大小。

1.3.2 复合磷酸盐对海捕虾仁影响

分别配制0.25%、0.50%、0.75%、0.90%、1.15%浓度复合磷酸盐溶液。控制反应时间6 min，反应温度10℃。测定其条件下的失水率跟剪切力大小。

1.3.3 温度对海捕虾仁的影响

配制好的腌制液置于0、5、10、15、20℃五个不同温度下，腌制处理6 min后测定虾仁失水率跟剪切力大小。

1.3.4 时间对海捕虾仁德影响

反应温度10℃，设定时间2、4、6、8、10 min下腌制处理后测定虾仁失水率跟剪切力大小。

1.3.5 正交试验优化虾仁嫩化条件

根据试验中失水率、剪切力等测定得到的数据为依据，以单因素试验落实各因素的水平取值范围，采用L9正交表制定正交试验方案，优化海捕虾仁蛋白嫩化条件。

1.4 海捕虾产品理化指标测定

1.4.1 蛋白溶解性的测定

在反应后，量取2 mg/m L虾肉糖基化后的蛋白溶液，4 000 r/min离心15 min后测定上清液中的蛋白值，与此同时采用考马斯亮蓝法得到溶液中的蛋白质含量[11]。

1.4.2 pH值的测定

称取海捕虾仁剪切打碎，分散到溶液中，用高速离心机于8 000 r/min进行离心10 min，取滤液，测其pH值。每个样品平行测3次，取平均值。

1.4.3 失水率的测定

用嫩化液腌制的5 g南美白对虾仁放于蒸煮袋中，在95℃水浴锅中加热10 min后冷却至室温，取出样品用滤纸清除表面水分后称重。失水率计算公式如下：

蒸煮失水率(%)＝（蒸煮前质量－蒸煮后质量）/蒸煮前质量×100%

1.4.4 剪切力的测定

研究设定测试数值：测试的深度(压缩比)保持50%，测定时稳定速度大小40 mm/min，在测试前后需速度确保一致为60 mm/min。往复来回2次，回复时长2 s。选用P/0.5柱形探头，测试速度1 mm/s，测试形变量50%。测试3个平行样品，取平均值[12]。

1.4.5 感官评定

选取10人接受过感官评定培训，熟悉海捕虾的质地、色泽，有着丰富的感官鉴定经验的人组成评定小组，以滋味、质地、气味、色泽综合得分为考察指标进行评定，感官评定表参见表1。

表1 感官评分参考表Tab.1 Sensory score reference table

2 结果与分析

2.1 海捕虾蛋白糖基化工艺条件

2.1.1 糖类对海捕虾蛋白改性效果

实验结果见图1，控制相同时间，反应温度跟浓度。糖基化后羧甲基纤维素钠虾肉蛋白含量最高，葡萄糖跟你壳聚糖效果差异不大，乳糖与原液相比蛋白含量变化最不明显[13]。再由感官评定结果看出，羧甲基纤维素钠跟葡萄糖得分高于乳糖跟壳聚糖。综合两结果，选择羧甲基纤维素钠对海捕虾仁蛋白改性效果最适当。

2.1.2 糖用量对海捕虾蛋白改性效果

海捕虾仁在不同羧甲基纤维素钠浓度下，蛋白改性结果数值变化如图2所示。当羧甲基纤维素钠添加量达8 mg/mL时，达到最大值为84.41 μg/mL,。继续增加羧甲基纤维素钠浓度，蛋白变化并不明显，慢慢保持平行状态。造成这种现象的原因可能是蛋白基团因空间结构而不能参加反应[14]。另根据感官评定分数看，跟据添加量的增多，感官分数先增后减，而6 mg/mL与8 mg/mL评分相差不大。综合反应结果与评分数据，选择羧甲基纤维素钠添加量8 mg/mL。

2.1.3 pH对海捕虾蛋白改性影响

根据下图3可以看出蛋白浓度随pH值的变化先升高，随后降低，在数值为8.2时达最高点。存在原因可能是低pH值下，蛋白质分子延展性高，糖基化的程度也大，使得反应程度加大。随着pH值的增大，限制蛋白分子延展，电负性难以增大，更难溶解[15]。而根据感官评定数据可得，评定分数随pH的增大先增后减。最高分跟最低分相差1分。pH为8跟8.2时相差0.4分。综合两者数据，选择pH为8.2对虾仁蛋白改性影响最大。

2.1.4 反应时间对海捕虾蛋白改性影响

保持其他条件相同，控制不同的反应时间。测定数据，绘制成图4。观察下图，可以发现，随着时间的增加，海捕虾仁蛋白浓度先随之上升，在20 min达到最高值后又逐渐降低，趋于平衡。从感官评定角度看，整体走势呈先增后减状态。在反应时间20 min时对海捕虾蛋白改性的感官评定分数最高。因此，综合两者数据，最终选择海捕虾蛋白糖基化反应时间保持20 min为最佳改性时间。

2.1.5 反应温度对海捕虾蛋白改性影响

如下图5所示，在反应温度达到55℃时，海捕虾蛋白浓度为80.28 μg/mL，之后随着温度的升高，其蛋白溶解度在缓慢的下降。这个原因可能是因为高温使得蛋白产生变性而析出，蛋白溶解性随之降低[16]。从感官评分角度出发，得出整体走势先加后减。在温度为50℃时达最高，与55℃下平均分相差0.2。基于这两者的数据考虑，最终选择55℃，海捕虾仁蛋白改性效果最好。

图1 不同糖类对虾仁蛋白改性效果Fig.1 Effect of different carbohydrate on shrimp protein

图2 羧甲基纤维素钠添加量对虾仁蛋白改性效果Fig.2 Effect of sodium carboxy methyl cellulose on shrimp protein modification

图3 pH值对虾仁蛋白改性影响Fig.3 Effect of pH on shrimp protein modification

图4 反应时间对虾仁蛋白改性影响Fig.4 Effect of reaction time on the modification of shrimp protein

图5 反应温度对虾仁蛋白改性影响Fig.5 Effect of reaction temperature on the modification of shrimp protein

2.1.6 正交优化实验

根据单因素实验的结果，选取羧甲基纤维素钠的添加量、反应时间、反应温度、pH值为考察因素，每个因素选取三个水平进行正交实验[17]，对海捕虾仁糖基化条件进行优化，糖基化的因素水平对照见表2，正交试验结果见表3。

表2 糖基化正交试验因素水平Tab.2 Glycosylation Orthogonal Test Factor Level

表3 正交实验结果Tab.3 Orthogonal Test Results Table

直观分析表3，可以看出，四个因素的极差由大到小依次为温度＞反应时间＞pH＞添加量，对海捕虾蛋白浓度的影响最大的是反应温度，添加量的影响性最小，反应时间跟pH比较接近。在实验条件下，最优的糖基化组合为A2B3C3D2，即反应时间20 min，反应温度60℃，羧甲基纤维素钠添加量为8 μg/mL，pH为8.4。此时的海捕虾蛋白浓度最佳，且感官评分可达4.75分。

2.2 海捕虾肉蛋白嫩化工艺试验

2.2.1 木瓜蛋白酶对海捕虾蛋白的影响

配置好6个溶度的木瓜蛋白酶溶液，然后测定处理后的各项指标，记录好数据。其结果如图6所示。

根据图6，可以清晰的看出木瓜蛋白酶对海捕虾仁剪切力及失水率的影响。当木瓜蛋白酶添加量达到1.5%时，虾仁剪切力随酶量增加在不断的下降。之后，随着木瓜蛋白酶添加量的幅度增加，其剪切力基本保持稳定状态，下降的幅度不大[18]。从失水率的总体角度而言，其数值相差并不呈现规律性，最低跟最高相差约4个百分点。综合而言，选择0.15%添加量其剪切力较高，失水率也较低。

图6 木瓜蛋白酶对海捕虾仁嫩度影响Fig.6 Effect of papain on the tenderness of sea shrimp

2.2.2 复合磷酸盐对海捕虾仁的影响

复合磷酸盐以六偏磷酸钠质量分数为30%，磷酸氢二钠的质量分数为30%，三聚磷酸钠的质量分数为40%比例配置。之后制成5个溶度的复合磷酸盐溶液，然后测定处理后的各项指标，记录好数据。其结果如图7所示。

根据图7，可以清晰的看出复合磷酸盐对海捕虾仁剪切力及失水率的影响。随着复合磷酸盐含量的增加，虾仁剪切力下降幅度并不是很明显，基本在一条直线上波动。从失水率的总体角度而言，添加复合磷酸盐后的虾仁失水率都低于不经处理虾仁[19]。综合剪切力大小及失水情况，选择0.5%添加量其剪切力较小，失水率也较低，且添加量也适量，较为经济。

2.2.3 温度对海捕虾仁的影响

设置5个温度梯度，将海捕虾仁放置其中，使其自然反应。然后测定处理后的各项指标，记录好数据。平行实验3次，取平均值。其结果如图8所示。

根据图8数据显示，可以看出温度对于虾仁剪切力及失水性的影响。整体上来看，随着温度的升高，剪切力跟失水率都在不断的下降，前期下降比较明显，15℃之后逐步趋于稳定，保持平缓速率[20]。10℃跟15℃剪切力相差1N，失水率相差2个百分点。综合温度对虾仁总体状态，选择将嫩化温度控制在10℃。

2.2.4 时间对海捕虾仁的影响

设置5个时间梯度，将海捕虾仁放置其中，使其自然反应。之后测定处理后的各项指标，记录好数据。平行实验3次，取平均值。其结果如图9所示。

根据图9，单论剪切力，随着时间的增加，其数值在缓慢的下降，最低与最高值相差了约1 N。而失水率走势并不遵循规律性，先降低，后增高又降低。在反应6 min时数值最低。综合剪切力与失水率的时间相关性，最终选择6 min为最佳反应时间。

2.2.5 正交试验结果

根据单因素实验的结果，选取木瓜蛋白酶添加量、反应时间、反应温度、复合磷酸盐添加量为考察因素，每个因素选取3个水平进行正交实验，对海捕虾仁嫩化条件进行优化，嫩化的因素水平对照见表4，正交试验结果见表5。

图7 复合磷酸盐对海捕虾仁嫩度影响Fig.7 Effect of compound phosphate on tenderness of sea shrimp

图8 温度对海捕虾仁的影响Fig.8 Effect of temperature on shrimp in sea

图9 时间对海捕虾仁的影响Fig.9 Effect of time on sea shrimp

表4 嫩化正交试验因素水平Tab.4 Level of orthogonal test factors

直观分析表5，可以看出，四个因素的极差由大到小依次为复合磷酸亚添加量＞时间＞木瓜蛋白酶添加量＞温度，对海捕虾剪切力的影响最大的是复合磷酸盐添加量，温度对其反应的影响性最小。在实验条件下，最优的嫩化组合为A2B3C2D2，即反应时间6 min，反应温度15℃，木瓜蛋白酶添加量为0.15 mg/m L，复合磷酸盐添加量为0.50 mg/m L。因四个因素极差均小于1，且数字相差并不大，另从表5看出，剪切力小于3N有两个组合，分别为为A2B3C1D2，A1B2C2D2。因此对这三个组合进行感官评定进行最终选择。其评定结果如图10所示。

根据上图显示，可以直观看出感官评定结果。A2B3C1D2在气味上所占分数最高，A1B2C2D2在质地跟色泽上，都稍优于另两个组合，且感官评定平均分也高于另两个组合。这可能是由于温度升高，使得虾仁的品质发生变化。因此，综合上述图表结果，最终选择复合磷酸盐0.50%，木瓜蛋白酶添加量0.15%，10℃下反应4 min。得出处理后样品的剪切力为2.80 N，比原剪切力3.52N降低了20.45%。

图10 感官评定最佳嫩化组合Fig.10 Sensory evaluation of the best tender combination

表5 正交实验结果Tab.5 Orthogonal Test Results Table

3 小结

（1）用羧甲基纤维素钠对海捕虾仁蛋白进行糖基化改性。通过单因素实验和正交试验的优化，得出糖基化改性的最佳条件为：羧甲基纤维素钠添加量为8 μg/mL，反应时间20 min，反应温度60℃，pH为8.4。各因素影响主次关系为温度＞反应时间＞pH＞添加量，对海捕虾蛋白浓度的影响最大的是反应温度。

（2）通过木瓜蛋白酶和复合磷酸盐对海捕虾仁嫩化试验。通过感官评定选择最佳实验条件：木瓜蛋白酶0.2%，复合磷酸盐0.4%，嫩化温度8℃。并根据单因素和正交试验结果，得出：复合磷酸亚添加量＞时间＞木瓜蛋白酶添加量＞温度。根据试验检验可知，确定的最佳组合嫩化工艺后虾肉的剪切力是2.80N，较原本的3.52N降低了20.45%。

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Study on Glycosylation Modification of Sea Shrimp Meat Protein

ZHENG Wei,XIE Chao
（School of Food and Medicine,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

The sea shrimp mainly includes red shrimp,brown shrimp,etc.,its small size,delicious meat,with high nutritional value and great economic development value,the role of the human health,especially children,pregnant women and the elderly Have a tonic effect.In this study,we used glyphylation treatment and tender treatment of sea shrimp using modern food processing technology.The optimal conditions for glycosylation were determined according to the single factor and orthogonal test.The optimum conditions were as follows:Methyl cellulose sodium added amount of 8 μg/mL,reaction time 20 min,reaction temperature 60 ℃,pH 8.4.The shear stress of the shrimp was 2.80N,which was 20.45%lower than that of the original 3.52N.The results showed that the shear strength of shrimp was 2.80N,which was the best combination of papain and compound phosphate.Through the experiment to optimize the processing and storage of ready-to-eat food,the development of the unique flavor,easy to open the bags of ready-to-eat products.

sea shrimp;protein;glycosylation;tenderization;convenience food

TS254.9

A

1008－830X(2017)03－0240－08

2017-03-09

浙江省公益性技术应用研究计划（农业项目）（2016C32080）

郑炜（1994-），男，陕西汉中人，硕士研究生，研究方向：水产品加工与储藏.E-mail:865262801@qq.com

谢超，副教授，研究方向：水产品加工与贮藏.E-mail:xc750205@163.com