甘油二酯异构体高效液相色谱分析法的建立

2017-09-18樊巧英曹迪迪张星星杜宣利张羽霄贺军波胡志雄张维农齐玉堂

中国油脂 2017年8期

关键词：异丙醇棕榈检测器

樊巧英,曹迪迪,张星星,杜宣利,张羽霄,贺军波,3,胡志雄,3,张维农,3,齐玉堂

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉430023; 2.西安中粮工程研究设计院有限公司，西安 710082; 3.农产品加工湖北省协同创新中心，武汉430023)

甘油二酯异构体高效液相色谱分析法的建立

樊巧英1,曹迪迪1,张星星1,杜宣利2,张羽霄2,贺军波1,3,胡志雄1,3,张维农1,3,齐玉堂1

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉430023; 2.西安中粮工程研究设计院有限公司，西安 710082; 3.农产品加工湖北省协同创新中心，武汉430023)

建立了1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯两种位置异构体的高效液相色谱分析方法。最佳色谱分析条件为蒸发光散射检测器(漂移管温度90℃，N2流速2.2 L/min)，流动相为乙腈-异丙醇(体积比95∶5)，流速1.0 mL/min，柱温35℃；最佳色谱条件下，测得 0.05～5.00 mg/mL质量浓度范围内，1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的标准曲线方程为Y=1.832X+4.564，线性回归系数R2=0.998 8，线性关系良好；该方法具有良好的精密度、准确度与重现性，适合结构脂质等样品中甘油二酯位置异构体定性、定量分析的要求。

甘油二酯；位置异构体；高效液相色谱-蒸发光散射检测器；优化

甘油二酯(DAG)是一类甘油三酯(TAG)中一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质，包括1,3-DAG与l,2-DAG两种异构体。近年来，随着人们对油脂的用途及营养作用越来越关注，结构脂质因其独特的生理作用现已成为研究热点，而1,3-DAG作为一种新型的结构脂质，因其在体内不会蓄积，具有减少内脏脂肪、降低血脂、缓解糖尿病、抑制体重等[1-4]特殊的生理功能而备受瞩目。因此，高纯度1,3-DAG的制备技术显得尤为重要。

通常，在DAG的合成过程中会产生1,3-DAG和1,2-DAG两种同分异构体，为此，必须建立一种对于两种DAG异构体的定性定量分析方法。目前，甘油酯的分析方法主要有薄层色谱法(TLC)[5-6]、高效液相色谱法(HPLC)[7-9]和气相色谱法(GC)[10-12]等。TLC法操作快速简单，但精度不高[13]；而GC法需要在高温条件下程序升温，造成响应值波动大，结果差别较大。相比而言，HPLC法是一种高效、准确的甘油酯分析方法[14]。通常该方法采用的检测器一般有紫外检测器(UV)、示差折光检测器(RI)和蒸发光散射检测器(ELSD)。甘油酯类物质通常在紫外处几乎没有响应，所以一般较少采用UV定量检测油脂天然成分；RI和ELSD都是通用型检测器，适用于无发色基团样品的分析，对各类物质都有响应，但是RI检测器易受环境温度和仪器系统的影响，且不能梯度洗脱，精度较差；而ELSD适用于梯度洗脱，具有更高的灵敏度和稳定性，被广泛用于甘油酯的分析中[15]。本研究通过优化色谱条件，直接分离检测1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯两种异构体，建立HPLC-ELSD法，为评价1,3-DAG的产品质量和指导1,3-DAG的选择性合成奠定定性和定量分析基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准品(纯度98%)、1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯标准品(纯度98%)，瑞典Larodan 公司；1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯样品，实验室合成。乙腈、异丙醇均为色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司。

电子分析天平；SK3300LHC型超声波清洗器；XW-80A微型旋涡混合仪；Milli-Q Integral超纯水系统；Waters高效液相色谱仪、2489紫外可见光检测器、2414示差折光检测器、1525二元泵、2707自动进样器、Empower色谱工作站，美国Waters公司；Agilent 1260高效液相色谱仪、G1311B四元泵、G1316A柱温箱、Alltech 3300型蒸发光散射检测器、Open LAB色谱工作站、C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘油二酯标准溶液的配制

配制质量浓度为10.0 mg/mL的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯、1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯标准溶液，分别将其依次稀释至0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL系列质量浓度。并将0.1 mg/mL 1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶液与0.05 mg/mL 1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯标准溶液混合均匀，作为待分离液，然后运用高效液相色谱进行分离检测。

1.2.2 高效液相色谱法的建立

从检测器类型、流动相组成、流速、柱温方面进行优化，建立1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的高效液相色谱检测方法，并通过高效液相色谱检测方法对1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯进行定性及定量分析。

1.2.3 1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准曲线的绘制

将上述系列质量浓度的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶液，按1.2.2建立的高效液相色谱法进行检测，记录相应峰面积。以峰面积的常用对数值为纵坐标，1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的质量浓度的常用对数值为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4 精密度实验

取低、中、高(0.05、0.1、1.0 mg/mL)3种不同质量浓度的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶液，每种分别采取在同天测定5次及连续5 d的测定方式进行高效液相色谱检测。根据测得峰面积得出实际样品质量浓度，计算测定结果的相对标准偏差(RSD)，用来评价方法的精密度。

1.2.5 加标回收率实验

取0.9 mL质量浓度分别为0.05、0.1 mg/mL的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯样品，向其中分别添加0.1 mL质量浓度依次为0(空白对照)、0.05、0.1 mg/mL的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶液，混合均匀。按照优化后的高效液相色谱法进行检测，根据目标峰的峰面积和标准曲线计算实际样品质量浓度，并计算样品加标回收率。

2 结果与分析

2.1 检测器的选择

通常，高效液相色谱法采用的检测器一般有紫外检测器(UV)、示差折光检测器(RI)和蒸发光散射检测器(ELSD)3种，为了确保所建立高效液相色谱法具有较高的灵敏度，结合现有实验条件，对上述3种检测器作了对比分析，实验结果如图1所示。由图1可以看出，UV作检测器时，甘油二酯的响应值较小，RI作检测器时，峰形对称性较差，出现了拖尾现象，两者均不利于后续分析；ELSD作检测器时，峰形对称性好，柱效及灵敏度较高。因此，选取ELSD作为后续分析时的检测器。

注：1. 1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯； 2. 1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯。下同。

图1不同检测器条件下1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯、1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯的HPLC图谱

2.2 色谱分析条件的优化

2.2.1 流动相的选择

在反相色谱分离体系中，流动相的组成一般为水、甲醇、乙腈或者极性有机溶剂的混合液等，由于DAG分子碳链较长，疏水性较强，综合考虑分析效率与分析成本，选择乙腈、异丙醇等常见强洗脱性能的溶剂较佳。本实验控制其他条件不变，流速1.0 mL/min，柱温35℃，ELSD漂移管温度90℃，N2流速2.2 L/min，选取一定比例的乙腈-异丙醇混合液作为流动相，通过调节异丙醇的比例，考察不同流动相组成对两种异构体的分离效果，结果如图2、表 1所示。从图2、表1可以看出，流动相中异丙醇的含量对样品保留时间影响较大，随着流动相中异丙醇含量的升高，样品保留时间不断缩短，其中100%乙腈作流动相时，1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯、1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯的保留时间分别为32.43、35.49 min，而体积比70∶30的乙腈-异丙醇作流动相时，其对应的保留时间仅为8.59、8.96 min；另外，随着流动相中异丙醇含量的升高，样品分离度和容量因子均随之不断减小，100%乙腈作流动相时，分离度可达2.30；而体积比70∶30的乙腈-异丙醇作流动相时，分离度仅为0.85。因此，从分析效率和分离度等因素综合考虑，选取体积比为95∶5的乙腈-异丙醇作流动相最为合适。

乙腈-异丙醇体积比保留时间/min1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯容量因子k分离度Rs100%乙腈32．4335．4922．572．3095∶526．3128．4115．542．2590∶1020．2821．809．261．6885∶1515．9617．037．311．1580∶2012．8413．625．861．0170∶308．598．961．830．85

2.2.2 流速的选择

流速是影响色谱柱效与分析效率的重要条件，因此有必要对流速进行优化。本实验在固定其他条件不变的情况下，分别选取流速为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min进行检测，比较不同流速条件下的分离效果。结果表明：随着流速增大，目标峰的保留时间逐渐减小，样品分析时间缩短，在流速为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min条件下，对应的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯的保留时间分别为30.6、27.0、24.1、21.8、19.9 min和33.0、29.1、26.1、23.6、21.5 min；其峰形逐渐变窄，且两目标峰间距逐渐缩小，但对分离度影响不大，以上流速条件下分离度均大于1.5，能达到基线分离的效果。综合考虑样品分析时间、流动相消耗、柱效等因素，选择最佳流速为1.0 mL/min。

2.2.3 柱温的选择

在色谱分离中，柱温对分离选择因子α和容量因子k有影响，为了获取最佳的α值与k值，控制柱温在30、35、40、45℃ 4个水平，考察柱温对分离效果的影响。结果表明，在不同柱温条件下，对两种异构体的分离度的影响不大，但随着柱温的升高，目标峰的保留时间逐渐减小，样品分析时间缩短。考虑到柱温对色谱柱寿命的影响，选取的最佳柱温为35℃。

2.3 1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的标准曲线

将1.2.1所配制的0.05～5.0 mg/mL 系列质量浓度的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶

液按照1.2.2所建立的优化条件分别进行色谱分析，记录相应色谱峰面积，以1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的质量浓度(C)的常用对数值为横坐标，峰面积(A)的常用对数值为纵坐标绘制标准曲线如图3所示。由图3可以看出，线性回归方程为Y=1.832X+4.564(R2=0.998 8)，表明在0.05～5.0 mg/mL质量浓度范围内，线性关系良好，灵敏度高，完全满足定量分析要求。

图3 1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的标准曲线

2.4 精密度实验

为考察方法的精密度，实验选取低、中、高(0.05、0.1、1.0 mg/mL)3种不同质量浓度的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶液，按照1.2.4方法进行高效液相色谱检测，结果如表2所示。由表2可以看出，同天重复测样的相对标准偏差在1.51%～3.48%范围内，回收率在94.61%～101.52%范围内；连续5 d 测样的相对标准偏差在1.65%～3.67%范围内，回收率在96.32%～102.50%范围内。表明该方法具有良好的重现性、精密度、准确度。

表2 精密度实验结果

2.5 加标回收率实验

取不同质量浓度(0.05、0.1 mg/mL)的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯样品0.9 mL，按照1.2.5方法分别添加一定量的1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯标准溶液，混合均匀后，按照优化后的高效液相色谱方法进行检测，根据目标峰的峰面积和标准曲线计算出实际样品质量浓度，并计算出样品加标回收率，结果如表3所示。

表3 加标回收率实验结果

由表3可以看出，所有样品的加标回收率均在98.00%～102.22%范围内，相对标准偏差在2.18%～4.25%范围内，表明该方法具有良好的准确性，符合测定要求。

3 结论

本实验建立了一种1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯与1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯分离检测的高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)方法，并优化了检测条件。最佳检测条件为：ELSD为检测器，ELSD漂移管温度90℃，N2流速2.2 L/min；流动相为体积比95∶5的乙腈-异丙醇；流速1.0 mL/min；柱温35℃。在此条件下1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的保留时间为26.31 min，1-月桂酸-2-棕榈酸甘油二酯保留时间为28.41 min。依据优化后的色谱条件，绘制1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的标准曲线，测得在0.05～5.0 mg/mL质量浓度范围内，1-月桂酸-3-棕榈酸甘油二酯的标准曲线方程为Y=1.832X+4.564，线性回归系数R2=0.998 8，线性关系良好。该方法重现性好，具有良好的精密度和灵敏度，适用于1,3-DAG的定量及定性分析。

[1] 乔晓萍, 蔡东联. 甘油二酯与代谢性疾病[J]. 食品科技, 2007, 32(1): 224-227.

[2] 邹冬芽, 孟祥河, 段作营, 等. 1,3-甘油二酯减肥降血脂功能的研究[J]. 营养学报, 2004, 26(5): 333-336.

[3] NAGAO T, WATANABE H, GOTO N, et al. Dietary diacylglycerol suppresses accumulation of body fat compared to triacylglycerol in men in a double-blind controlled trial[J]. J Nutr, 2000, 130(4): 792-797.

[4] SAITO S, TOMONOBU K, HASE T, et al. Effects of diacylglycerol on postprandial energy expenditure and respiratory quotient in healthy subjects[J].Nutrition, 2006, 22(1): 30-35.

[5] FUCHS B, SÜβ R, TEUBER K, et al. Lipid analysis by

thin-layer chromatography—a review of the current state[J]. J Chromatogr A, 2010, 1218(19): 2754-2774.

[6] 周思, 王志耕, 梅林, 等. 乳脂中1,3-甘油二酯检测方法的研究[J]. 中国油脂, 2011,36(7): 67-70.

[7] FEDOSOV S N, FERNANDES N A, FIRDAUS M Y, et al. Analysis of oil-biodiesel samples by high performance liquid chromatography using the normal phase column of new generation and the evaporative light scattering detector[J]. J Chromatogr A, 2014, 1326(1): 56-62.

[8] 钟南京, 李琳, 李冰, 等. 甘油酯的液相色谱分析[J]. 现代食品科技, 2012, 28(1): 123-126.

[9] 汪勇,宋坷珂, 王丽丽, 等. 反相高效液相色谱法测定甘油二酯含量研究[J]. 中国粮油学报, 2010, 25(3): 119-123.

[10] 李长秀, 唐忠, 杨海鹰. 气相色谱法测定生物柴油样品中脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油酯的含量[J]. 分析测试学报, 2005, 24(5): 66-68.

[11] LIPP M.Determination of the adulteration of butter fat by its triglyceride composition obtained by GC. A comparison of the suitability of PLS and neural networks[J]. Food Chem, 1996, 55(4): 389-395.

[12] 王志远, 李晓, 周超群, 等. 苹果籽油脂肪酸及甘油三酯组成分析[J]. 粮食与油脂, 2015, 28(1):36-38.

[13] 孟祥河, 章银军, 毛忠贵. 甘油酯的分析方法[J]. 中国油脂, 2004, 29(1): 44-46.

[14] CARELLI A A, CERT A. Comparative study of the determination of triacylglycerol in vegetable oils using chromatographic techniques[J]. J Chromatogr A, 1993, 630(1/2):213-222.

[15] HOPIA A I, OLLILAINEN V M. Comparison of the evaporative light scattering detector (ELSD) and refractive index detector (RID) in lipid analysis[J]. J Liquid Chromatogr Related Technol, 1993, 16(12):2469-2482.

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Determinationofdiacylglycerolpositionalisomersbyhighperformanceliquidchromatography

FAN Qiaoying1, CAO Didi1, ZHANG Xingxing1, DU Xuanli2, ZHANG Yuxiao2, HE Junbo1,3, HU Zhixiong1,3, ZHANG Weinong1,3, QI Yutang1

(1.College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2.Xi’an COFCO Engineering Research & Design Institute Co., Ltd., Xi’an 710082, China; 3.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

A HPLC method was developed for the separation of 1-laurin-3-palmitin diacylglycerol and 1-laurin-2-palmitin diacylglycerol. The optimal chromatographic analysis conditions were obtained as follows: evaporative light scattering detection (ELSD) as detector (drift tube temperature 90℃ and N2flow rate 2.2 L/min), mobile phase of acetonitrile-isopropanol (volume ratio 95∶5), flow rate 1.0 mL/min, column temperature 35℃. Under the optimal chromatographic analysis conditions, the standard curve equation of 1-laurin-3-palmitin diacylglycerol (mass concentration range 0.05-5.00mg/mL) wasY= 1.832X+ 4.564 with a good linear regression coefficient (R2=0.998 8). The method showed good reproducibility, precision and accuracy, which was beneficial for the qualitative and quantitative analysis of diacylglycerol positional isomers in structural lipids.

diacylglycerol; positional isomers; high performance liquid chromatography- evaporative light scattering detector; optimization