高效液相色谱手性固定相法拆分山莨菪碱

郭小倩，沈静茹，沙 涛，章冰娜，舒亚玲，雷新友

(中南民族大学 化学与材料科学学院 分析化学国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074)

高效液相色谱手性固定相法拆分山莨菪碱

郭小倩，沈静茹*，沙 涛，章冰娜，舒亚玲，雷新友

(中南民族大学 化学与材料科学学院 分析化学国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074)

以双[-6-氧-(-3-脱氧柠檬酸单脂-4)]-β-环糊精键合全多孔型硅珠为HPLC手性固定相，以甲醇和三氟乙酸-三乙胺缓冲液为流动相，探究流动相比例、缓冲液浓度、缓冲液pH值、检测波长、色谱柱温和流速等条件对山莨菪碱二个外消旋体拆分效果的影响。在最佳分离条件(三氟乙酸浓度2mmol/L，pH值4.1，V甲醇∶V缓冲液=50%∶50%，流动相流速为0.5 mL/min，色谱柱温20℃，检测波长235nm)下山莨菪碱混合物被拆分为二个外消旋体，实现了基线分离，Rs达4.20；并得到了四个对映异构体拆分的结果。

山莨菪碱；手性分离；双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精；高效液相色谱手性固定相

以环糊精(CD)及其衍生物作为手性选择剂在高效液相色谱手性固定相中实现药物拆分仍旧是目前非常重要的工具[1]。环糊精独特的分子结构，同时拥有疏水性空腔和亲水性边缘，对手性拆分十分有利[2]。 β-环糊精衍生物更是具有优良的选择性和广泛的分离范围[3]。山莨菪碱(Anisodamine)，含两个手性中心，是一种作用于自主神经系统的抗胆碱药物[4]。在临床方面，山莨菪碱对过敏性休克、急性肾炎导致的合并心力衰竭、突发阑尾炎、高血压导致的脑部疾病甚至敌敌畏中毒等均取得了较好疗效，另外对于治疗美尼尔氏综合征、炮震性耳聋、妊娠中毒症、胰腺炎、视网膜脉络膜炎、颅脑外伤等疾患亦有不同程度的疗效[5]。因其对多种疾患的良好治疗效果，使得山莨菪碱对映体的分离研究十分必要[6]，Yang L M等人用ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱将山莨菪碱拆分为两个外消旋体，然后用Daicel 的CHIRALPAK AD-H柱(在5μm粒径硅珠表面涂覆直链淀粉衍生物手性柱)在液相色谱中分离了山莨菪碱的两对异构体。本文用双 [-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-CD键合硅珠手性HPLC固定相，实现了山莨菪碱外消旋体混合物的拆分，在一根HPLC手性柱上同时将山莨菪碱拆分为二个外消旋体，达到基线分离，同时实现了山莨菪碱四个对映异构体拆分的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪UItimate3000(赛默飞世尔科技有限公司)，超声波清洗器(宁波科生仪器厂，As3120型)；酸度计(上海伟业仪器厂，ZD-2型)；电磁搅拌器(上海华光仪器仪表厂，CJ-1型)；山莨菪碱标准品(中国食品药品检定研究所)；其它试剂均为分析纯。

1.2 样品前处理及实验条件

配制浓度4.2×10-4mol/L山莨菪碱标准品，经0.22μm滤膜过滤。将市售99.5%三乙胺与三氟乙酸配制成不同pH值的缓冲溶液，并与甲醇按比例混合作为流动相。流动相分别用0.22μm水系膜和有机膜过滤，脱气，备用。

色谱柱：自制双[-6-氧-(-3-脱氧柠檬酸单脂-4)]-β-环糊精键合硅珠固定相HPLC手性柱(150 mm×Φ4.6mm)；甲醇与三氟乙酸(浓度2mmoL/L)缓冲液为流动相，检测波长235nm，流速0.5mL/min，进样量20μL，柱箱温度20℃。

2 结果与讨论

2.1 探究缓冲液pH值变化对山莨菪碱分离情况的影响

以V甲醇∶V三氟乙酸-三乙胺=50%∶50%，在1.2的色谱条件下，山莨菪碱标准品浓度为4.2×10-4mol/L，缓冲液pH值在3.0～6.7范围变化。结果示例如图1所示，pH值3.0时，山莨菪碱混合物二外消旋体有较好分离，在pH值为4.1时，水峰干扰小；随着酸度减小，pH值达到6.0时，可以发现分离出多个峰，存在多个对映体的分离。

a)pH值3.0；b)pH值4.1；c)pH值6.0

图1 不同pH值条件下的HPLC图

Fig.1 HPLC chromatograms under different pH conditions

2.2 探究流动相配比变化对山莨菪碱分离情况的影响

以三氟乙酸-三乙胺缓冲液pH值为4.1，在1.2色谱条件下，山莨菪碱标准品浓度为4.2×10-4mol/L，调节V甲醇∶V缓冲液分别为60%∶40%，50%∶50%，40%∶60%，30%∶70%，20%∶80%，拆分结果示例如图2所示，结果显示，缓冲体系中V甲醇∶V缓冲液的变化对分离结果影响较大，当流动相中甲醇比例较高，占60%时，有分离迹象，但峰形对称性不高，分离度不佳；随着甲醇含量降至50%时，山莨菪碱二个外消旋体混合物达到较好分离，且峰形对称；随着甲醇含量继续降低，对映体的分离逐步实现。

图2 不同流动相配比条件下的HPLC图

Fig.2 HPLC chromatograms under different mobile phase ratios

2.3 精密度和线性范围

在山莨菪碱混合物二个外消旋体最佳分离条件下将浓度为4.2×10-4mol/L的山莨菪碱标准品重复进样7次，计算得到二个外消旋体的保留时间tR、峰面积A、峰高h和分离度Rs各参数的RSD分别为0.16%、0.04%、1.42%、0.16%，1.76%、0.11%和1.82%，分离度RS值均在4.29至4.60之间，说明二个外消旋体色谱峰保留时间的重现性最佳，峰面积重现性也优于峰高的重现性，而且后峰各项参数的重现性都优于前峰，说明溶剂对前峰有一定影响，分离度的重现性也低于2%。 山莨菪碱标准品溶液浓度在2.10×10-4～1.05×10-3mol/L范围内，分别考察峰高、峰面积与浓度的线性关系，结果显示前峰峰面积-浓度线性方程为y=2884x-2.518，线性相关系数r=0.9894；前峰峰高-浓度线性方程为y=20038x-2.212，线性相关系数r=0.9869；后峰峰面积-浓度线性方程为y=3911x-0.528，线性相关系数r=0.9935；后峰峰高-浓度线性方程为y=23623x-3.629，线性相关系数r=0.9955。说明山莨菪碱二个外消旋体在该浓度范围内，呈现出良好的线性关系，后峰的线性关系优于前峰。

2.4 对比试验

图3 对比试验

Fig.3 The comparison spectrum在1.2的色谱条件下以V甲醇∶V缓冲液=20%∶80%，缓冲液pH值为4.1，用4.2×10-4mol/L山莨菪碱标准品与溶剂水作对照实验，结果如图3所示，图3a为山莨菪碱的四个异构体完全分离色谱图，图3b显示溶剂(水)峰对山莨菪碱的分离干扰有限。

3 总结

使用自制的以双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精为手性选择剂的HPLC色谱柱，在Ultimate3000智能型高效液相色谱仪上对山莨菪碱的拆分结果是有效的，获得了山莨菪碱混合物的二个外消旋体手性分离的最佳分离条件，考察精密度，各参数RSD均小于2%。在2.10×10-4～1.05×10-3mol/L范围内，山莨菪碱的二个外消旋体浓度与峰高和峰面积有线性相关性，在甲醇与缓冲液体积比为20∶80, 其他条件不变时，可实现山莨菪碱的四个对映异构体的拆分，在一根色谱柱上同时实现了山莨菪碱二个外消旋体和四个对映异构体的分离，为高效液相色谱手性固定相法拆分山莨菪碱提供了新方法。

[2] Xia L,Zhou Z M,Di X,et al.Enantiomeric separation in high-performance liquid chromatography using novel β-cyclodextrin derivatives modified by R-configuration groups as chiral stationary phases[J]. Talanta,2011,84(4):1080-1092.

[3] Li L,Zhang M,Wang Y,et al.Preparation of chiral oxazolinyl-functionalized β-cyclodextrin-bonded stationary phases and their enantioseparation performance in high-performance liquid chromatography[J].Journal of separation science,2016,39(21):4136-4146.

[4] Bai S,Fu X,Gu X,et al.Intracoronary administration of different doses of anisodamine in primary percutaneous coronary intervention: protective effect in patients with ST-segment elevation myocardial infarction[J].Coronary Artery Disease,2016,27(4):302-310.

[5] Eisenkraft A,Falk A.Possible role for anisodamine in organophosphate poisoning[J].British Journal of Pharmacology,2016,173(11):1719-1727.

[6] Yang L M,Xie Y F,Chen H Z,et al.Diastereomeric and enantiomeric high-performance liquid chromatographic separation of synthetic anisodamine[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2007,43(3):905-909.

(本文文献格式：郭小倩，沈静茹，沙 涛，等.高效液相色谱手性固定相法拆分山莨菪碱[J].山东化工,2017,46(7):110-111,114.)

Separate Anisodamine Enantiomers by the Chial High Performance Liquid Chromatography Stationary Phase

GuoXiaoqian，ShenJingru*，ShaTao，ZhangBingna，ShuYaling，LeiXinyou

(Key Laboratory of Analytical Chemisty of the State Ethnic Affair Commission, College of Chemistry and Materials Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

Anisodamine enantiomers have been separated by a chiral chromatographic column with bis-[6-oxygen-(3-deoxycitric acid monoester-4)]-β-cyclodextrin. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to explore the optimum resolution conditions of anisodamine racemic mixture. The optimum conditions: detection wavelength 235nm, pH4.1, trifluoroacetic acid concentration is 2.0mmol/L, Vmethanol∶ Vbufferis 50%∶50%, the flow rate is 0.5mL/min, and the temperature of column is 20℃. Under this condition, the anisodamine racemic mixtures have been separated andRsis 4.20，and a HPLC method for four enantiomorphism isomers separation results has been developed.

anisodamine;enantioseparation;bis-[6-oxygen-(3-deoxycitric acid monoester-4)]-β-cyclodextrin; HPLC chiral stationary phase

2017-01-08

中央高校基金资助项目(CZW14053)

郭小倩(1990—)，女，湖北荆州人，硕士研究生，主要从事手性药物拆分研究。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)07-0110-02