大豆过敏原β-伴大豆球蛋白提取纯化工艺研究

□ 蒋栋磊 葛攀玮 俞程凯 郭 伟 葛庆丰 方维明 扬州大学 食品科学与工程学院

大豆过敏原β-伴大豆球蛋白提取纯化工艺研究

□ 蒋栋磊 葛攀玮 俞程凯 郭 伟 葛庆丰 方维明 扬州大学 食品科学与工程学院

大豆蛋白具有丰富的营养价值，而其致敏性却给大豆敏感人群带来了极大的危害。其中7S伴大豆球蛋白是一种主要过敏原。本实验采用碱溶酸沉法从大豆中分离纯化出β-伴大豆球蛋白（7S伴大豆球蛋白）。通过设置浓度、料液比、pH、提取液的单因素对比实验，研究对大豆球蛋白提取的影响，并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯 胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对提取的7S伴大豆球蛋白进行了纯度分析。结果显示，使用pH9．0、浓度为0．10 mol/L的Tris-HCl缓冲液在料液比1︰18的条件下，7S伴大豆球蛋白提取率为47%。

大豆蛋白；分离纯化；正交试验

大豆蛋白质是高品质植物蛋白质来源，营养价值非常高[1-2]。而大豆蛋白却是一种主要的过敏原，其能引起人体严重的过敏反应[3-4]。大豆中约有35%～40%的蛋白，以不同的沉降系数，可分为2S球蛋白、7S球蛋白、11S球蛋白和15S球蛋白[5-8]。其中，7S球蛋白和11S球蛋白约占大豆蛋白质总量的70%[9-10]。

本实验以大豆中的7S球蛋白为研究对象，设置不同的提取条件，通过对目标蛋白的分离纯化，进行SDSPAGE电泳分析。用电泳成像仪对结果进行对比鉴定，建立快速高效提取大豆过敏原蛋白的方法，为大豆过敏蛋白的检测以及大豆过敏蛋白标准品的制备，提供一定的基础性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料与试剂：优质黄大豆、丙酮、10%过硫酸铵溶液、Tris-HCl缓冲液、十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇和电泳凝胶制备试剂盒试剂等。

实验仪器：HJ-4A型磁力搅拌器、台式高速冷冻离心机、微型垂直电泳系统、凝胶电泳成像仪和多功能酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 大豆脱脂

粉碎机将大豆粉碎成粉末，过60目筛，收集过筛的大豆粉，4 ℃保存。大豆粉与丙酮溶液按1︰5混合（m/v），磁力搅拌1 h后进行抽滤，收集固体，重复上述步骤数次，直至上层液体无色，4 ℃离心取沉淀，-4 ℃保存。

1.2.2 大豆蛋白浸提

控制浸提液浓度为0.05 mol/L、pH9.0、料液比1︰10，设置不同种类提取液：PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液；设置不同pH：pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0；设置不同浓度提取液：0.03、0.05、0.10 mol/L和0.20 mol/L；设置不同的料液比：1︰10、1︰15、1︰18、1︰20。提取率计算方法为：提取率=大豆提取蛋白质量/脱脂大豆蛋白粉质量×100%。

1.2.3 SDS-PAGE分析

建立蛋白浓度标准曲线，检测样品中的蛋白浓度，并将大豆蛋白样品于PBS溶液中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.4 大豆致敏蛋白纯化和分析

将样品封装于透析袋（36 mm）中，透析24 h后,浓缩干燥，进行SDSPAGE分析。采用考马斯亮蓝G250法测定目标蛋白浓度。

2 结果分析

2.1 单因素对大豆致敏蛋白浸提的影响

由图1（A）可知，Tris-HCl缓冲液的提取率都高于PBS缓冲液的提取率，故选用Tris-HCl缓冲液为提取液；由图1（B）可知，料液比为1︰18时，能够提取大部分的球蛋白，故选取料液比1︰18作为最佳提取料液比；由图1（C）可知，当Tris-HCl提取液浓度为0.1 mol/L时，7S伴大豆球蛋白的提取率最高，最终选取0.1 mol/L为最佳提取浓度；由图1（D）可知，pH9.0时提取率最高。最终选取pH9.0为最佳提取pH。

2.2 大豆蛋白的纯化

由图2可以发现，与Marker相对比较，7S球蛋白经纯化后，杂蛋白被除去，只留下7S球蛋白的主要蛋白含量Gly m Bd 30K，可知纯化成功。

2.3 大豆致敏蛋白含量测定结果

建立蛋白标准曲线：y=0.020 5x+0.147 6，其中，R2=0.991 8。经纯化透析后的7S球蛋白约16 mL，并测定其OD值为0.17，计算得纯化后的蛋白含量为1.1 mg/mL，获得7S球蛋白总量为17.6 mg。

3 结论

依据单因素对比实验及正交试验，最终确定提取大豆致敏蛋白的最佳条件，并经过SDS-PAGE验证鉴定。最佳提取条件为：提取液浓度pH9.0、提取液浓度0.10 mol/L、Tris-HCl缓冲液、料液比1︰18。通过最佳工艺提取出来的蛋白样品，此条件下可获得含量为1.1 mg/mL的7S球蛋白。

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图1 单因素对大豆致敏蛋白浸提的影响图

图2 透析纯化的大豆球蛋白电泳图

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国家自然科学基金面上科学基金项目（编号：31271945）；国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：31601535）；江苏省自然科学基金青年基金项目（编号：BK20 160459）；江苏省高校自然科学研究面上项目（编号：16KJB550008）；扬州市社会发展前瞻性研究项目（编号：YZ2014177）。

蒋栋磊（1986—），男，江苏无锡人，博士，讲师。研究方向：食品安全检测。

方维明（1965—），男，江苏扬州人，博士，教授。研究方向：农产品加工及贮藏。